微量测定木聚糖酶活力的新方法——MBTH法

建立一种木聚糖酶活力的微量测定新方法--3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法。根据木聚糖及其酶解产物的特殊性,研究MBTH法的显色条件,并以多点测定法对酶活力测定中的几个关键参数进行探讨。结果表明：蛋白质在其质量浓度低于30μg/mL时对测定无干扰;木聚糖溶液的最佳测定质量浓度为4mg/mL;较高的酶解温度会使木聚糖酶在测定过程中失活,因此,酶活力测定的最佳温度为30℃,而远低于该酶的最适温度;酶解时间为60min以内;酶解产物与MBTH试剂的反应时间应控制在13～16min之间,以15min为最佳。以酶解时间为30min计,本法检测限为0.135mU/mL,定量限为0.451mU/mL,适当延长酶解时间可相应提高酶活力检测灵敏度。该法准确度高,结果稳定,灵敏度远高于DNS法。     

RSM法优化产β-葡聚糖酶的发酵培养基

采用响应面法对重组大肠杆菌BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl产β-葡聚糖酶发酵培养基成分进行优化.首先采用Plackett-Burman设计从培养基组成中筛选出了对产酶水平有显著影响的甘油、酵母粉、NaCl三种成分,利用Box-Benhken设计对浓度进行优化,结果表明,它们的最佳浓度分别为18.9、45.6、5.3g/L,产β-葡聚糖酶水平为2311.81U/mL,较优化前提高了23%.     

泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化

从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33。依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6 d。在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447 U/m L,为优化前的17.6倍。     

黑曲霉HS-5高产β-葡聚糖酶发酵条件的优化

利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定酶活,优选黑曲霉(Aspergillus niger)HS-5发酵产β-葡聚糖酶的发酵条件。在单因素试验的基础上,采用中心组合试验原理设计响应面法优化工艺条件,得到最佳发酵条件为接种量3.11%,初始p H值为6.09,发酵时间60.02 h。在此最佳条件下,测得β-葡聚糖酶的酶活力为20.03 U/m L,比初始酶活力12.98 U/m L提高了154%。     

淀粉液化芽孢杆菌产β-葡聚糖酶培养基优化以及酶稳定剂的研究

采用正交试验方法,进行了淀粉液化芽孢杆菌发酵产β-葡聚糖酶培养基的优化。结果表明,采用玉米粉30g/L,大麦粉40g/L,豆饼粉30g/L,Na2HPO4.12H2O 6g/L,(NH4)2SO4 4g/L,CaCl2 0.8g/L,MgSO4.7H2O1g/L组成的培养基发酵,β-葡聚糖酶活力达到128.55U/mL,比优化前提高了22.48%。在β-葡聚糖酶溶液中添加大分子亲水型多糖黄原胶、动物蛋白明胶、甘油、氯化钠可明显提高β-葡聚糖酶的热稳定性。将添加甘油120g/L、黄原胶5g/L复合稳定剂的葡聚糖酶溶液60℃处理2h,酶液的残余酶活比未经处理的酶活提高了55.3%。     

产纤维素酶荷叶内生真菌的筛选与鉴定

利用次氯酸钠和乙醇消毒法对荷叶内生真菌进行分离。采用羧甲基纤维素钠培养基筛选产纤维素酶的菌株。结果得到2株产纤维素酶的荷叶内生真菌,分别命名为HY3和HY4。菌株HY3和HY4的内切葡聚糖酶酶活力分别为44.46 U/m L和28.23 U/m L、外切葡聚糖酶酶活力分别为5.80 U/m L和7.82 U/m L、滤纸酶活力分别为12.04 U/m L和13.52 U/m L。依据菌落形态和ITS序列分析鉴定HY3为Rhodosporidiobolus sp.,HY4为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)。     

高效阴离子交换色谱法测定婴幼儿配方奶粉中酵母β-葡聚糖

建立一种测定婴幼儿配方奶粉中酵母β-葡聚糖的分析方法。奶粉样品经蛋白酶酶解去除蛋白质,脂肪酶酶解去除脂肪,葡聚糖酶酶解β-葡聚糖产生葡萄糖,经高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测,计算β-葡聚糖含量。结果表明,最优酶解条件为：酶解温度50 ℃、酶解时间2.0 h、溶壁酶添加量500 μL。采用PA10阴离子交换柱进行分离葡萄糖,葡萄糖在0.10～50.0 mg/L范围内线性良好（R2＞0.999 5）,添加水平在10.0～50.0 mg/100 g范围的回收率为96.9%～102.1%,精密度试验结果相对标准偏差为2.43%（n=5）,方法检出限为3.0 mg/100 g,定量限为10.0 mg/100 g。该方法灵敏、准确,可用于婴幼儿配方奶粉中酵母β-葡聚糖的测定。     

酶法测定大麦提取物中β-葡聚糖含量的研究

在国际β-葡聚糖酶法测定β-葡聚糖含量的基础上,用纤维素酶代替昆布多糖水解酶水解β-葡聚糖,用β-葡聚糖酶代替β-葡萄糖苷酶,用苯酚-硫酸法代替葡萄糖试剂盒法测定β-葡聚糖酶解后得到葡萄糖含量,设计了适合我国应用的β-葡聚糖酶法测定方法。此法测定过程为：1．5mL浓度为60μg/mL的标准β-葡聚糖和一定浓度的样品,用浓度为50U/mL纤维素酶0．5mL酶解60min；然后用蒸馏水稀释至30mL,从中吸取0．5mL到另一试管,再加入浓度为2U/mLβ-葡聚糖酶1mL,作用15min后,用苯酚-硫酸法测定标准β-葡聚糖和样品酶解液中葡萄糖含量,计算出样品中β-葡聚糖的含量。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达

在大肠杆菌中实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表达。将实验室自主开发的信号肽ff53与β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)进行融合连接到p ET-28a(+)上;通过优化诱导表达条件,28℃、8 g/L乳糖诱导10 h,重组菌E.coli BL21/p ET-ff53-bgl发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到1093 U/m L,与IPTG诱导的重组菌E.coli BL21/p ET-bgl(583 U/m L)相比,提高了0.87倍。本研究为高密度发酵制备该酶奠定了基础。     

耐热β葡聚糖酶发酵培养基的优化

本文利用响应面分析对耐热β-葡聚糖酶的发酵培养基进行优化,结果表明:最适发酵培养基组成为大麦粉43.48g/L、豆粉34.40g/L、Na Cl 2.4g/L、磷酸二氢钾2.4g/L和磷酸氢二钾12.5g/L;优化后的发酵培养基发酵产β-葡聚糖酶的量为(110±2.67)U/m L,比初始发酵培养基提高了11%。优化后的发酵培养基中的碳源和氮源是廉价的大麦粉和豆粉,大大降低了β-葡聚糖酶的生产成本,具有很好的实际应用价值。     

酵母β-葡聚糖水解酶的表达及应用

酵母β-葡聚糖是一种具有多种生物功能的细胞壁结构多糖,但天然的酵母β-葡聚糖水溶性较差,影响了其在医疗、保健食品和化妆品行业中的应用。作者通过β-1,3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1,6-葡聚糖水解酶BT3312水解酵母β-葡聚糖制备小分子酵母葡聚糖,提高其水溶性。以大肠杆菌为宿主,异源表达β-1,3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1,6-葡聚糖水解酶BT3312。在25℃条件下,添加0.2 mmol/L IPTG诱导后,Gly5m和BT3312的最高酶活分别为1 086 U/mL和2 355 U/mL。酵母β-葡聚糖经过Gly5m和BT3312水解后,溶解率分别提高了2.6倍和2.4倍。采用Gly5m和BT3312共同水解,酵母β-葡聚糖溶解率提高了3.2倍(水溶性酵母葡聚糖的质量浓度为12.5 g/L)。因此,Gly5m和BT3312在提高酵母葡聚糖的水溶性和制备小分子酵母葡聚糖领域具有重要的应用价值。     

氮源对裂褶菌产裂褶多糖和β-1,3-葡聚糖酶的影响

本论文初步探讨了利用裂褶菌发酵体系所产的内切β-1,3-葡聚糖酶对发酵产生的裂褶多糖进行适度酶解,以获得分子量适中溶解度较好的裂褶多糖的可能性。以裂褶多糖产量和β-1,3-葡聚糖内切酶和总酶活为考察指标,采用刚果红琼脂染色法和摇瓶培养,从四株裂褶菌GIM5.42、GIM5.43、GIM5.44、Sc1中筛选出多糖产量和酶活都相对较高的菌株GIM5.43,多糖产量和酶活分别为2.29g/L与0.28 U/m L。在摇瓶中考察了氮源及其添加方式对裂褶菌菌体生长、裂褶多糖产率、β-1,3-葡聚糖酶的酶活及其影响规律。结果表明:菌体生长及其分泌胞外多糖和葡聚糖酶的最适酵母浸膏和氯化铵的添加时间和添加量是不同的。为了保证多糖产率,采用分批补加策略,初始酵母浸膏浓度1.00 g/L,发酵第6 d补加0.10 g/L酵母浸膏,多糖产量为4.16 g/L,比未优化提高了61.24%,总酶活为0.34 U/m L,提高了142.86%。     

响应曲面法优化酵母β-葡聚糖酶解工艺及产物分析

采用β-葡聚糖酶对酵母β-葡聚糖进行酶解,利用单因素和响应面实验,以水溶性酵母β-葡聚糖得率为指标优化酶解工艺,并对水溶性酵母β-葡聚糖与原酵母β-葡聚糖的结构和热稳定性进行了研究。最佳酶解条件:底物质量浓度1.14 g/100 mL,酶活浓度0.16 U/mL,温度44℃,pH 4.2,水溶性酵母β-葡聚糖得率为39.89%。红外光谱分析结果表明,水溶性酵母β-葡聚糖与原酵母β-葡聚糖的糖苷键型均为β构型,分子构象相同。热稳定性分析表明,水溶性酵母β-葡聚糖和原酵母β-葡聚糖的特征分解温度分别为356℃和360℃,终止分解温度分别为740℃和780℃,热稳定性差异不大。     

β-葡聚糖酶活力测定方法的研究进展

本文综述了β-葡聚糖酶活力的测定方法,如黏度法、生色底物法、琼脂糖扩散法、酶联免疫吸附分析法(ELISA)和目前使用较多的还原端基法,如3,5-二硝基水杨酸(DNS)法、Somogyi-Nelson法、二金鸡纳酸(BCA)法和最新涌现的用于微量测定的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法,并就还原端基法介绍了其具体实验手段,如试管法、罐法、微孔板法、流动注射法(FIA)。分析了方法中存在的问题并展望了β-葡聚糖酶活力测定方法研究的发展趋势,如安培法和等温滴定量热法等。     

响应面法优化植物乳杆菌产β-半乳糖苷酶发酵培养基

采用单因素试验分析不同碳源、氮源对植物乳杆菌KLDS1.0628产β-半乳糖苷酶的影响,在此基础上利用Plackett-Burman,Box-Behnken实验设计对发酵培养基成分含量进行优化。结果表明,Plackett-Burman设计筛选出3个主要因素为乳糖、乙酸钠、柠檬酸氢二铵,其最佳质量浓度分别为16.41,10.21,5.83 g/L。在优化后的培养基下,β-半乳糖苷酶活可达3.32 U/m L,与理论预测值3.40 U/m L基本一致,酶活比优化前提高了73.8%。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌诱变选育及基因克隆表达

为获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌株,以高地芽孢杆菌YC-9为出发菌株,通过亚硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)和低能N+束诱变育种,筛选和选育得到两株突变株N-2-2和10-30s-3,发酵培养60 h,酶活力分别达到28.6 U/m L和36.1 U/m L,分别是出发菌株的2.36倍和2.98倍,与YC-9菌株相比,突变菌株菌体生长下降但发酵产酶量增加。进一步将β-1,3-1,4-葡聚糖酶克隆并在大肠杆菌中成功表达,经过30℃诱导6 h后,胞内酶活力达79.2 U/m L,为出发菌株的6.5倍。     

酶法测定大麦提取物β-葡聚糖含量研究

目前国际认可β-葡聚糖含量测定方法是酶法,此法测定成本高,我国目前多采用苯酚- 硫酸法测定,但测定结果准确性较差。该研究在国际β-葡聚糖酶法测定基础上用纤维素酶代替昆布多糖水解酶水解β-葡聚糖,用苯酚-硫酸法代替葡萄糖试剂盒法测定β-葡聚糖酶解后得到葡萄糖含量,设计适于我国应用的β-葡聚糖酶法测定方法。此法测定过程为:1．5 ml浓度为60μg／mL 标准β-葡聚糖和一定浓度样品,用浓度为50U／mL纤维素酶0．5 ml酶解60 min;然后用蒸馏水稀释至30 ml,从中吸取0．5 ml到另一试管,再加入浓度为2 U／mL β-葡聚糖酶1ml,作用15 min后,用苯酚-硫酸法测定标准β-葡聚糖和样品酶解液中葡萄糖含量,计算出样品中β-葡聚糖含量。     

嗜酸乳杆菌产β-半乳糖苷酶发酵条件的优化

采用Plackett-Burman试验设计从影响Lactobacillus acidophilus CICC6075产β-半乳糖苷酶的15个因素中筛选出3个显著因素,然后通过响应面分析法优化最佳发酵工艺参数,测定其在最适产酶条件下的酶活力。结果表明：影响嗜酸乳杆菌产酶的显著因素为发酵温度、酵母粉质量浓度和柠檬酸三胺质量浓度,其最佳工艺条件分别为36℃、6.22g/L、2.35g/L。在此条件下最高酶活力的预测值为3.95U/L,与实测值(3.98U/L)十分接近。本实验利用优化工艺发酵产酶,酶活力提高了近两倍。     

天麻醇提物对灰树花发酵菌丝体多糖及β-葡聚糖合成量的影响

在灰树花液体深层发酵体系中添加天麻醇提物,考察天麻醇提物对灰树花发酵菌丝体生物量、菌丝体多糖及β-葡聚糖含量的影响,并进一步研究起显著促进作用的关键特征成分;同时,采用高效液相色谱法对7 g/L天麻醇提物中的特征成分进行定量分析,研究了对灰树花菌丝体生物量、菌丝体多糖及β-葡聚糖起促进作用的关键特征成分及优化添加量。结果表明,适当浓度的天麻醇提物能够显著提高灰树花菌丝体生物量、菌丝体多糖及β-葡聚糖的含量,在其质量浓度为7g/L时,菌丝体干重、菌丝体多糖及β-葡聚糖含量均达到最大值,分别为1.708 g/L、5. 974%和2. 055 mg/g,与不添加天麻醇提物相比分别增加了0. 36、1. 29和1. 44倍(P<0. 05)。天麻醇提物中的特征成分分别为天麻素5. 837 5 mg/g,对羟基苯甲醇1.107 2 mg/g,对羟基苯甲醛0.660 1 mg/g,对灰树花菌丝体生物量、菌丝体多糖及β-葡聚糖起促进作用的关键特征成分均为对羟基苯甲醛,其.优化添加量分别为100、250、150 mg/L。     

泡盛曲霉β-1，3-1，4-葡聚糖酶的纯化、性质及其用于制备β-葡寡糖

作者研究了泡盛曲霉(Aspergillus awamori)一种β-1,3-1,4-葡聚糖酶(AaBglu29)的纯化、性质及其水解燕麦麸皮制备葡寡糖。粗酶液采用硫酸铵沉淀、QSFF强阴离子柱和DEAE-52弱阴离子柱层析3步纯化,得到电泳级纯酶,经SDS-PAGE和Sephacryl-100测定的相对分子质量分别为30.7×10~3和27.6×10~3。该酶最适pH为5.0,最适温度为55℃。AaBglu29底物特异性专一,对大麦葡聚糖、燕麦葡聚糖和地衣多糖的比酶活力分别为9 500、7 950 U/mg和5 980 U/mg。该酶水解燕麦麸皮产生葡三糖和葡四糖,经优化,当底物质量分数为5%,加酶量为100 U/g时,于50℃、pH 5.0条件下水解4 h,葡寡糖转化率可达90%。AaBglu29优良的酶学特性使其在食品和饲料工业具有较大的应用潜力。