植物乳杆菌重组亚油酸异构酶的表达与纯化

对转化有植物乳杆菌亚油酸异构酶基因的大肠杆菌进行诱导表达,表达出大量重组亚油酸异构酶蛋白,但大部分目的蛋白形成了包涵体,用8mol/L尿素将包涵体蛋白溶解变性后,用金属螯合层析对重组蛋白进行了纯化.当咪唑溶液浓度为50mmol/L时,重组蛋白开始被洗脱下来;当咪唑溶液浓度为200mmol/L时,蛋白洗脱效果最佳;浓度为400mmol/L时,重组蛋白完全被洗脱下来.纯化后重组蛋白的收率为84.71%.     

蜂毒肽在大肠杆菌中的高效融合表达与纯化

生物法制备蜂毒肽是实现大量制备蜂毒肽的关键技术。为实现蜂毒肽的高效表达,通过化学法合成含信号肽、前导肽和成熟肽的蜂毒肽基因promet和蜂毒肽成熟肽基因met,与麦芽糖结合蛋白基因mbp连接,克隆到载体pET15-b,构建重组质粒pET-MBP-MET和pET-MBP-proMET。重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）,以0.1 mmol/L IPTG进行诱导,30 ℃下过夜诱导,融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达。两种目标蛋白质经Ni柱和Dextrin Sepharose HP两步亲和纯化,得到了纯度达90%以上的融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET,培养1 L大肠杆菌菌液能制备约20 mg纯蛋白质。通过牛津杯抑菌实验发现,MBP-MET、MBP-proMET能明显抑制细菌生长,产生明显的抑菌圈,MBP-MET和MBP-proMET最低抑菌浓度（MIC）分别为100 μg/mL和140 μg/mL。本研究首次实现了蜂毒肽的高效表达,并进行了抑菌功能验证,为生物法制备蜂毒肽提供了高效、安全的合成途径。     

大肠杆菌重组几丁质酶的表达、包涵体复性及酶学性质研究

通过研究重组几丁质酶在大肠杆菌表达系统中诱导表达的浓度、时间和温度,获得表达的最佳条件。表达产物除了可溶性目的蛋白以外,仍存在于包涵体中。采用透析复性和Ni-NTA亲和层析柱上复性两种方法对包涵体中的目的蛋白进行复性,并比较对目的蛋白产率和比酶活的影响。并考察了亲和层析柱上复性时的上样量、洗脱速率和温度对酶活的影响。结果发现,表达的几丁质酶可以采用透析和亲和层析柱上复性,亲和层析柱上复性的比酶活为1347.7 U/mg,明显高于透析复性,但产率明显低于透析复性。对1 m L的Ni-NTA亲和层析柱,较低浓度的蛋白复性液在0.4 m L·min-1洗脱速率下,降低上样量和温度,可以提高复性效率。复性后的几丁质酶对荧光底物具有较高活性,反应的最适温度为37℃,最适p H为3.8。      

天蚕素抗菌肽(Cecropin A)融合蛋白的表达及其分离纯化工艺研究

通过单因素实验确定了天蚕素抗菌肽融合蛋白表达的最佳条件,即温度为31℃,种子菌接种量为2.0％,培养基pH值为6.5,诱导时间为10 h,此时融合蛋白的表达量占细胞总蛋白的30.6％;开发融合蛋白纯化工艺,将工程菌细胞超声破碎后,所得包涵体使用8 mol/L尿素溶液溶解,泵入2 mol/L尿素溶液中搅拌使蛋白质复性,复...     

重组融合蛋白MBP-BSH 在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定

选择IF2融合标签,另选择含SUMO、GST、NusA和MBP融合标签的质粒构建表达载体。SDS-PAGE电泳结果显示,重组菌Escherichia Rosetta(DE3) (pLS932-BSH)的诱导表达细胞提取液上清出现了明显的融合蛋白MBP-BSH条带,经诱导表达条件优化后,MBP-BSH可溶性大幅度提高。用Ni-NTA Resin和Amylose Resin分别进行目标蛋白纯化,结果显示前者效果更好,并且C端融合His-Tag更有利于其与Ni离子结合,MBP-BSH蛋白纯化量更大,杂带更少。茚三酮显色反应测定酶活力,结果显示纯化后的MBP-BSH的酶比活力为2.4282U/mg。     

大肠杆菌中表达Cry1C基因及其重组表达产物的纯化及复性

通过PCR方法将苏云金芽孢杆菌Cry1C基因从原始质粒中克隆出来。由于Cry1C基因携带了大量大肠杆菌稀有密码子,因此用PCR方法对其前86个密码子进行修改,以提高其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达量。Cry1C蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式大量表达,将包涵体用8mol/L尿素溶解并用His TrapTM FF凝胶柱纯化。所得纯化蛋白在复性缓冲液中复性折叠,最终得到可溶并有生物活性(由三化螟活性实验验证)的蛋白。Cry1C蛋白纯度可达99.2%。     

自动诱导表达体系表达片球菌素融合蛋白

分别采用IPTG诱导和自动诱导方法诱导E.coli BL21（DE3）基因工程菌表达片球菌素融合蛋白;采用稀释方法对变性后的片球菌素融合蛋白包涵体进行复性,复性后融合蛋白经Ni-IDA柱分离纯化后经肠激酶酶切得目的片球菌素蛋白;以单核细胞增多症李氏杆菌为指示菌,采用牛津杯法测定所得到的片球菌素活性,并对其热稳定性,耐酸碱性和耐蛋白酶活性进行了分析。实验结果表明,经过诱导后,IPTG诱导菌液最终OD₆₀₀值为3.5000,而自动诱导为7.6998,IPTG诱导融合蛋白包涵体采用尿素溶解后的蛋白浓度为0.1001 mg/m L,而自动诱导为0.2359 mg/m L;自动诱导体系所获得的片球菌素融合蛋白产量优于IPTG诱导体系。所获得的片球菌素对单核细胞增多症李氏杆菌有抑制作用,热稳定性好,耐酸性强而耐碱性弱,对胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶和蛋白酶K敏感,可以被降解。自动诱导体系可以应用于片球菌素融合蛋白的E.coli BL21（DE3）基因工程菌高效表达片球菌素。      

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

几丁质结合蛋白基因克隆、表达与纯化

该研究通过聚合酶链反应（PCR）方法从假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.）DL-6菌株中成功克隆了几丁质结合蛋白基因。PCR测序结果表明,该基因全长1 596 bp,编码531个氨基酸,其理论分子质量为58.517 ku,等电点（pI）4.35,命名为CBP58（GenBank登录号KF234016）。结构域分析结果表明,该蛋白包括1个33家族碳水化合物结合模块（CBM）,2个类型3几丁质结合域（ChtBDs）;用Insight II 2005软件以同源建模的方法构建CBP58蛋白CBM33结构域的三维结构模型,Ramachandram图谱检测和三维结构评估显示模型结构合理,整体相容性较为可信;将CBP58基因构建到pET23b载体,并转化至大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中诱导表达;利用镍柱亲和层析纯化获得重组蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示目的蛋白可溶表达,为后期几丁质结合蛋白（CBP）的生化性质表征奠定理论基础。     

重组谷氨酸脱羧酶的表达条件优化、纯化及酶学性质研究

为了利用从γ-氨基丁酸（GABA）高产菌株——短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306中克隆并表达的谷氨酸脱羧酶进行GABA的生物制备,研究了影响重组工程菌E.coliBL21（pET28α（＋）-gad）生长的培养基组成和攸关GAD表达水平的诱导条件,优化了这些关键因素,提高了重组GAD的表达水平。采用Ni-NTA亲和纯化方法实现了对所得重组GAD的纯化,获得了纯酶,并确定了重组GAD产生GABA的最适pH值和温度,为该酶的工业应用创造了条件。     

共轭亚油酸的生理功能及其合成、纯化研究检测方法

共轭亚油酸是一系列位置和几何异构体的总称，其中的活性异构体具有多种重要的生理功能，近年来受到越来越多的重视。对活性共轭亚油酸异构体的主要生理功能、微生物合成共轭亚油酸的微生物菌种及合成途径中的关键性酶、目前使用的共轭亚油酸的化学合成方法、以及共轭亚油酸的纯化及分析检测方法进行了综述。     

植物乳杆菌亚油酸异构酶的分离纯化及其性质研究

经硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤,由植物乳杆菌(LactobacillusplantarumL 2 9)分离纯化得到亚油酸异构酶,分子量为4 3ku。对其酶学性质进行研究,结果表明,温度37℃、pH 6 0时酶活性较高;Co2 + 、Fe2 + 可提高酶的活性,Cu2 + 、Zn2 + 则对酶活力有抑制作用;该酶作用于亚油酸的Km=2 5 3×10 -5mol/L ,Vmax=2 5 7×10 -8mol/ (min·mg)。     

利用绿色荧光蛋白建立包涵体变-复性新方法

为提高常规稀释复性方法的复性效率,以重组绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)包涵体为模型,开发一种新的双变性- 稀释复性方法。新方法选取含有精氨酸的碱性复合溶液作为第一变性剂溶解GFP 包涵体,通过梯度降低变性液的酸碱度析出溶解目的蛋白,再以尿素为第二变性剂溶解析出的蛋白,随后进行稀释复性。结果显示：与常规方法比,新方法复性的绿色荧光蛋白活性收率提高至1.5～2.3 倍,复性蛋白对温度、溶液酸碱度及变性剂的稳定性提高。增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP,EGFP)及其融合蛋白的包涵体采用新方法进行复性,均取得80% 以上的活性回收率,说明新方法对GFP 系列融合蛋白的包涵体具有一定的适用性。新方法从变性剂使用与包涵体结构的关系出发,突破常规操作中变性剂单次使用的局限,既保留了简便性又提高了常规稀释复性方法的效率。     

Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。     

降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定

基于自组装肽ELK16能在大肠杆菌细胞内自聚集的特性,本研究将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接,构建能在体外自剪切的重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行蛋白表达条件的优化,得到目的蛋白聚集体,随后对聚集体进行DTT切割条件的优化,经过进一步纯化最终可得到纯度为98.15%、产量为5.53mg/g菌体湿重的Aglycin肽。采用基因工程手段重组表达Aglycin的产量比目前化学提取方法提高了近100倍。此外,经体外实验证明,Aglycin对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50(36.48μmol/L)比阿卡波糖(991.33μmol/L)低,说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,这进一步证明Aglycin有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。     

Linoleic acid Isomerase Activity in Enzyme Extracts from Lactobacillus Acidophilus and Propionibacterium Freudenreichii ssp. Shermanii

Enzyme extracts from Lactobacillus acidophilus (CCRC14079) and Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii (CCRC11076) were reacted with linoleic acid at 50 °C for 10 min at pH 5, 6, 7, and 8, and the levels of conjugated linoleic acid (CLA) formation were determined by high performance liquid chromatography. CLA formations were observed in all the reactions catalyzed by the retentates using ultrafiltration membranes with 100 kDa nominal molecular weight cutoff, indicating the presence of the activity of linoleic acid isomerase with nominal molecular weight higher than 100 kDa in the retentates from two cultures. More CLA was formed at pH 5 of L. acidophilus treatment and t10c12, c11t13, and c9t11 CLA were 3 major CLA isomers produced. Results demonstrate a potential for CLA production through linoleic acid isomerase.     

基因共表达对人源LysoPLD异源可溶性表达、纯化及酶学性质的影响

目的:为实现人源溶血磷脂酶D(LysoPLD)的原核异源可溶性表达.方法:通过NCBI检索,确定人源LysoPLD基因序列(GenBank:L46720.1).采用密码子优化后的序列,克隆至pET-28a表达载体中,采用共表达麦芽糖结合蛋白融合标签(MBP)和共表达促蛋白正确折叠分子伴侣触发因子Triggerfacto...     

蛇毒类凝血酶基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin)基因克隆到载体pET32-a(+)上,在T7lac启动子下以N端融合硫氧还蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,诱导条件为:30℃诱导6 h,IPTG浓度为1 mmol/L.利用固定化金属离子(Ni2+)亲和层析分别对胞内可溶物和变性条件下的包涵体进行纯化.通过SDS-PAGE检测融合蛋白的纯度,采用点杂交和纤维蛋白凝结活性检测分析,显示纯化产物具有较高生物活性.