谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用

为了研究在枯草芽孢杆菌发酵过程中添加相对廉价的辅酶前体对谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活力和催化效率的影响,将来源于Escherichia coli的谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过构建重组质粒p HY300PLK-gadB,在枯草芽孢杆菌中重组表达,得到重组菌B. subtilis/pHY300PLKgadB。研究了分别在重组菌发酵过程中添加辅酶磷酸吡哆醛(PLP)、辅酶前体吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)对GAD酶活力的影响。当设置摇床转速200 r/min,发酵温度33℃,发酵培养基初始p H 7.0时,在发酵过程中分别添加PLP、PL、PN至终浓度0.5 mmol/L,诱导48 h后发酵液中总酶活分别达到25.40、28.14、15.55 U/mL,是对照总酶活的1.55、1.72、0.95倍。基于以上结果,进一步研究了发酵过程中PL的添加浓度对重组菌生长情况及GAD表达的影响。结果表明,发酵液中GAD总酶活随着PL浓度的增加而增加,当PL浓度为0.1 mmol/L时,总酶活最高达到28.28 U/mL。利用重组菌全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA),结果表明,最适转化pH为5.0,最适转化温度为40℃,发酵过程中添加PL的重组菌(简称"GAD-PL")和发酵过程中不添加任何辅酶及辅酶前体的重组菌(简称"GAD-0")的最适加菌量(以酶活力单位计)分别是40 U/g(以谷氨酸计)和50 U/g(以谷氨酸计),当谷氨酸最终质量浓度达到400 g/L时,得到的GABA质量浓度分别为275.60 g/L和273.61 g/L。     

表达谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建及其发酵条件的优化

谷氨酸脱羧酶（GAD）是生物合成γ-氨基丁酸（GABA）的关键酶,本研究通过基因工程构建了一株产GAD的重组枯草芽孢杆菌,并对其产GAD的发酵条件进行优化。分别通过单因素法、正交实验、极差分析和响应面法确定了最佳培养基成分（g/L）及发酵条件为:蔗糖23.5,豆粕10、乙酸铵为8.5、磷酸二氢钾4.1、七水硫酸镁0.5,p H7.0,培养温度37℃。在优化条件下GAD酶活达到0.413 U/m L,与优化前的GAD酶活0.143 U/m L相比,酶活提高了188.8%。本研究有助于后续开发枯草杆菌生产γ-氨基丁酸的工艺,以克服现在γ-氨基丁酸生产工艺中,大肠杆菌安全性的问题和乳酸菌成本过高的问题。      

巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶的表达及其酶活性研究

谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)能够催化L-谷氨酸(盐)脱羧反应生成γ-氨基丁酸,它是微生物发酵法生产γ-氨基丁酸的关键酶,具有很高的工业应用价值。本文将来源于巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶(Bm Gad)经克隆至表达载体pET21b后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,并采用亲和层析的方法将该酶纯化后,用比色法测定该酶的酶活性。结果表明,BmGad克隆表达后,采用SDS-PAGE分析可知其相对分子质量约为5.3×10~4 Da。重组蛋白经亲和纯化后,该酶的最适温度为50℃,酶活性达到153U/mg;最适p H为5,酶活性为151 U/mg,在偏中性环境中比较稳定,适合于工业化生产的应用。     

重组谷氨酸脱羧酶的表达条件优化、纯化及酶学性质研究

为了利用从γ-氨基丁酸（GABA）高产菌株——短乳杆菌Lactobacillus brevis CGMCCNO.1306中克隆并表达的谷氨酸脱羧酶进行GABA的生物制备,研究了影响重组工程菌E.coliBL21（pET28α（＋）-gad）生长的培养基组成和攸关GAD表达水平的诱导条件,优化了这些关键因素,提高了重组GAD的表达水平。采用Ni-NTA亲和纯化方法实现了对所得重组GAD的纯化,获得了纯酶,并确定了重组GAD产生GABA的最适pH值和温度,为该酶的工业应用创造了条件。     

1 株产γ-氨基丁酸植物乳杆菌谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

以1 株产γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BC114谷氨酸脱羧酶为研究对象,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术获得该酶基因,对其进行生物信息学分析,并转入大肠杆菌BL21（DE3）中实现异源表达。采用实时荧光定量PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分别测定重组菌不同发酵时间点谷氨酸脱羧酶基因的表达量、蛋白表达量以及产GABA能力。结果表明：植物乳杆菌中谷氨酸脱羧酶基因大小为1?410?bp,编码469?个氨基酸,蛋白二级结构由α-螺旋（32.2%）、β-折叠（11.5%）和无规则卷曲（56.3%）构成,完成了该酶的三维结构同源建模;成功构建了重组谷氨酸脱羧酶大肠杆菌,谷氨酸脱羧酶基因在诱导6?h相对表达量最大,而蛋白表达量较基因在转录水平表达量有一定滞后,在8?h达最大值,此时GABA产量也达最高,为2?387?mg/L。     

不同乳酸菌产谷氨酸脱羧酶特性研究

通过对发酵乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌所产谷氨酸脱羧酶(GAD)的酶学性质进行比较,分析酶反应温度、pH值、磷酸吡哆醛(PLP)浓度、酶浓度与酶活性的关系,并对高活性乳酸菌GAD酶的米氏常数进行测定。结果表明,3株乳酸菌GAD酶的最适温度为40℃,最适pH值为4.5,在PLP添加量为0.1mol/L时,对酶的促进作用达到最高,发酵乳杆菌Km值为0.05215mmol/L,最大反应速度Vmax=2.08μmol/min;短乳杆菌Km值为0.0243mmol/L,最大反应速度Vmax=1.01μmol/min。     

微生物谷氨酸脱羧酶研究进展

文章综述了谷氨酸脱羧酶的研究概况,包括微生物来源及分布、在微生物中的作用、酶学特性、酶的结构及基因工程,并对其研究前景进行了展望。     

生物合成γ-氨基丁酸酿酒酵母谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达

为了提高酵母菌的γ-氨基丁酸产量,本研究以十六烷基三甲基溴化铵法(hexadecyl trimethy ammonium bromide,CTAB)提取的酿酒酵母28基因组DNA为模板,扩增得到序列长度为1 758 bp的GAD1基因,经比对与S.cerevisiae S288c的一致性达到98.58%,并设计引物扩增包括GAD1基因上游启动子及调控序列,下游终止子在内的全长基因序列,长度为3 490 bp。将全长基因序列克隆至高拷贝质粒p UG6,构建重组质粒p28。以菌株28作为出发菌株进行转化,经G418抗性筛选得到转化子,进一步经过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)实验验证,质粒提取及酶切验证,确证得到重组子DL28。经重组质粒p28的特性研究得知,重组质粒p28具有良好的遗传稳定性,无抗性传代培养10次重组质粒不丢失。转化后进行酶活力测定,重组子DL28的谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)酶活力比菌株28提高73.8%。通过以上实验结果得出结论,GAD基因高表达菌株DL28具有更高的G418抗性和GAD酶活性。     

乳酸乳球菌谷氨酸脱羧酶B重组质粒的构建、异源表达及酶学性质的研究

目的：旨在研究乳酸菌谷氨酸脱羧酶B(Decarboxylation of glutamic acid,gadB)的异源表达及其酶学性质。方法：以Lactocus lactis subsp. lactis Il1403的gadB基因序列为目的基因,实现gadB在大肠杆菌中的异源表达,探究其酶学性质,实现高效催化合成γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid,GABA)。结果：重组菌经IPTG诱导gadB过量表达后,进一步采用Ni²⁺亲和层析纯化gadB,经SDS-PAGE分析,在54 ku处出现明显条带,经检测可溶性蛋白含量约占70%。对酶学性质进行研究,gadB的最适pH值为4.8,最适反应温度为40℃,Na⁺和Mn²⁺限制gadB的酶活力,而Mg²⁺和Zn²⁺明显刺激酶活。对酶底物浓度进行研究,谷氨酸脱羧酶B的K_m为123.83 mmol,V_max为0.79 mmol/min。结论：该研究探索了gadB的酶学性质,为基因工...     

乳酸菌谷氨酸脱羧酶的酶学性质研究

本文对一株乳酸菌所产谷氨酸脱羧酶的酶学性质进行了较系统的研究,其中包括酶的热稳定性、pH稳定性及温度、pH和一些化学物质对酶活的影响。结果表明:此酶的最适温度为52℃,最适pH为4.5,米氏常数Km=24mmol。PLP、VB6及Ca2 在一定程度上都能促进酶活,且在含量小于100μmol时,作用程度为PLP>VB6>Ca2 。乙酸浓度小于0.05mol/L也能提高酶活力。     

玉米胚谷氨酸脱羧酶的性质

研究了玉米胚谷氨酸脱羧酶(GAD)的性质。结果表明:玉米胚GAD的最适温度为40℃,最适pH为5.7,其热稳定较差,60℃下保温1 h,酶活下降至39%,85℃时酶完全失活,而此酶在pH4.5～7.5可保持80%以上的酶活。玉米胚GAD对Glu的Km值和Vmax分别为51.87 mmol/L和1.807 mg/min。另外,KCl、NaCl和SDS对玉米胚GAD活性有较大的抑制作用,而Ca2+对此酶的活性有较强的激活作用,可提高底物与玉米胚GAD的亲和力。     

发芽糙米与稻谷的谷氨酸脱羧酶活力及γ-氨基丁酸含量比较

比较了糙米与稻谷发芽期间及培养结束后的静置过程中谷氨酸脱羧酶(GAD)活力、γ-氨基丁酸(GABA)及谷氨酸(Glu)含量变化情况。结果表明,糙米和稻谷在(32±1)℃条件下,以1.2 L/min的通气量,用含有0.1%L-谷氨酸、0.1%抗坏血酸的培养液浸渍发芽,生长速率和呼吸速率均以糙米为快。培养结束时,发芽糙米中GABA含量和Glu含量分别比发芽稻谷增加64.05%和14.68%,空气中放置8 h后发芽糙米中GABA含量比发芽结束时增加了24.32%,整个发芽和静置期间发芽糙米中GAD活力始终高于发芽稻谷。     

基于定向进化技术提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶活性

为提高巨大芽孢杆菌谷氨酸脱羧酶活性,通过定向进化技术对其进行酶工程改造。经过二轮易错聚合酶链式反应,从13 000 多个突变株中筛选到突变株A5-3、E2-4、E3-11,相对于野生型,其酶比活力提高了157%、115%、97%,且Kcat/Km都有所增大。其中A5-3氨基酸序列发生了2 个突变（A55D和D451E）。三维模拟结果表明,第55位丙氨酸突变为天冬氨酸很可能为酶促反应提供H＋,从而加快酶促反应效率;突变株E2-4第34位由亮氨酸突变成谷氨酰胺,一定程度上改善了酶的热稳定性;突变株E3-11的第325位由丙氨酸突变成丝氨酸有利于蛋白内部形成更多氢键,增大了该部位的柔性,更有利于氨基酸残基之间发生相互作用。圆二色谱分析表明,突变株与野生型具有相似的三维结构,相比于野生酶,突变酶的α-螺旋减少,无规则卷曲增加,说明突变酶刚性有所下降而柔性增加。利用定向进化技术可以明显改善谷氨酸脱羧酶的酶活性,为其工业化的应用提供实验参考。     

牛凝乳酶原基因在食品级乳酸乳球菌中的重组表达

将牛凝乳酶原基因连接pNZ8149载体,并转化乳酸乳球菌NZ3900,经乳酸链球菌素Nisin诱导,测得重组菌株胞内凝乳酶活力达到0.7 SU/mL,培养基中检测不到凝乳酶活力,实现了牛凝乳酶原基因在乳酸链球菌Nisin诱导基因表达系统（nisin controlled gene expression system,NICE）中活性表达。在此基础上,将分泌信号肽SPusp45连接于pNZ8149,构建了分泌型表达载体pNZ8149s,并实现牛凝乳酶原基因在NICE系统中分泌表达。当使用1 ng/mLNisin诱导5 h后,重组菌株胞内检测不到凝乳酶活力,培养基中凝乳酶活力为1.2 SU/mL,说明pNZ8149s能够促使凝乳酶原从乳酸乳球菌中分泌。该方法为重组牛凝乳酶在食品级菌株中重组表达提供了一种可行的方案。     

Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403谷氨酸脱羧酶的克隆表达、分离纯化及活性研究

谷氨酸脱羧酶(GAD)是功能因子γ-氨基丁酸(GABA)生物合成过程中的重要酶。为了得到一种有高效活性的GAD基因工程菌,克隆到一种GAD基因,来源于微生物Lactococcus lactis subsp.lactis IL1403。以pET-22b(+)为载体质粒,Escherichia coli BL21(DE3)为宿主细胞,构建了基因重组菌,IPTG可诱导目的重组GAD过量表达;经亲和层析纯化的重组蛋白质样品进行SDS-PAGE分析,在约54 000处出现显著的特征蛋白质条带;活性检测结果表明,该重组GAD的转化活性比野生菌株有明显提高,野生菌株经5h细胞转化,反应底物转化率为55.8%,而工程菌20min后转化率达到82.1%,30min后转化可达到98.3%。     

大肠杆菌谷氨酸脱羧酶的结构、功能及其基因表达调控

谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)广泛存在于原核和真核细胞,催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸和CO2。GAD的生物学功能和基因表达调控机制是当前研究的热点。对模式生物大肠杆菌(Es-cherichia coli)GAD的研究已取得了很大进展。文中综述了E·coliGAD的结构、功能及其基因表达调控机制的研究进展,为GAD的应用和基因操作提供理论依据,也为阐明GAD在真核生物中的生物学功能和基因表达调控机制提供了重要线索。     

嗜热链球菌谷氨酸脱羧酶基因及其侧翼区序列分析

从嗜热链球菌Streptococcus thermophilus Y-2的谷氨酸脱羧酶基因(gadB)及其两侧旁邻序列出发,在GenBank中分别用Blastn、Blastx 搜索同源序列。gadB 在核酸水平上无法找到同源序列,在蛋白质水平上与多种细菌的谷氨酸脱羧酶同源。根据谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列构建系统发育树,菌株Y-2 与具核梭杆菌Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum ATCC 10953 的亲缘关系最近。gadB 的上游侧翼区与嗜热链球菌LMG 18311 的插入序列IS1216转座酶基因具有很高的相似性。gadB 的下游侧翼区在核酸水平上未找到同源序列,在蛋白质水平上与谷氨酸/γ- 氨基丁酸转运蛋白有很高的相似性。菌株Y-2 的gadB、gadC 排列方式与大肠杆菌、弗氏志贺菌的相同,而与乳酸乳球菌、短小乳杆菌的相反。在已完成全基因组测序的3 个模式株Streptococcus thermophilus LMG 18311、CNRZ1066、LMD-9 中均含有插入序列 IS1216,但未发现谷氨酸脱羧酶基因gadB、谷氨酸/γ- 氨基丁酸转运蛋白基因gadC。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。