7株米曲霉与沪酿3.042发酵制备郫县豆瓣用甜瓣子的对比研究

为了筛选高效的具有潜在应用价值的郫县豆瓣生产专用米曲霉菌株,研究了7株高产蛋白酶、α-淀粉酶的米曲霉试验菌株(24M-1、21M-2、25M-1、19M-2、BM-2、18M-1、DM1)与沪酿3.042米曲霉在制备甜瓣子中的发酵性能差异,考察了不同菌株发酵的种曲中中性蛋白酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶的酶活力差别;进一步评价了由试验菌株制作的种曲发酵的甜瓣子的氨基酸态氮、总酸、挥发性风味物质、感官评价等发酵特性指标。结果表明,菌株24M-1、DM1发酵甜瓣子的各项发酵特性指标表现突出,甜瓣子的综合品质较佳,明显优于沪酿3.042米曲霉发酵的甜瓣子,可进一步优化菌株培养条件及发酵工艺参数,为其在郫县豆瓣加工中的应用奠定了基础。     

甜面酱微生物多样性、高产蛋白酶菌株的筛选鉴定及产酶条件优化

为解析传统甜面酱中微生物群落结构及筛选高产蛋白酶菌株,利用宏基因组学技术探究其中微生物的演替规律,通过滤纸片法与福林法从中筛选高产蛋白酶菌株,并采用单因素试验及响应面试验优化其产酶条件。结果表明,甜面酱发酵过程中的优势真菌为曲霉属（Aspergillus）、接合酵母属（Zygosaccharomyces）、威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）;优势细菌为芽孢杆菌属（Bacillus）、拟杆菌属（Bacteroides）、假单胞菌属（Pseudomonas）。筛选到一株高产蛋白酶细菌PC9,其被鉴定为莫海威芽孢杆菌（Bacillus mojavensis）。菌株PC9最优产酶条件为：1%果糖,1%酵母浸膏,0.5%硫酸铵,1%NaCl,发酵温度28.5℃,发酵时间2.0 d、初始pH 9.0、接种量6%。在此优化条件下,碱性蛋白酶活力达到404.153 U/mL,是优化前的8.42倍。     

鲢鱼鱼露酿造用米曲霉的筛选研究

以筛选酿造鲢鱼鱼露的米曲霉为研究目标,从酱油曲精中分离得到68株菌株,初筛确定10株具有典型米曲霉形态且在蛋白酶产生茵培养基平板上有液化圈的菌株.分别测其蛋白酶酶活,筛选出4株具有较高蛋白酶活力的米曲霉菌株.分别以上述4株菌株作为发酵菌株进行三级筛选,发酵后测其α-氨基氮的含量,结果得到1株发酵后α-氨基氮含量高的菌株,达0.963 g/100 mL,并将该菌株命名为Aspergillus Oryzae L-9.     

八宝豆豉制曲过程中微生物多样性与蛋白酶活性的动态变化及其潜在相关性

该研究采用高通量测序技术研究八宝豆豉制曲过程中微生物的演替规律,并对3种蛋白酶活性进行动态监测,进而利用皮尔森相关性分析建立优势菌属与蛋白酶活性的潜在关系。高通量测序结果表明,八宝豆豉制曲过程中,细菌菌群多样性高于真菌菌群多样性,且发酵使得微生物群落结构产生了较大的差异,从中共确定出9种优势微生物属（相对丰度＞1%）,包括6种优势细菌属和3种优势真菌属,且以芽孢杆菌属（Bacillus）和曲霉属（Aspergillus）为主。蛋白酶活性分析结果表明,碱性和中性蛋白酶为制曲阶段的主要蛋白酶。皮尔森相关性分析结果表明,Bacillus、Aspergillus、葡萄球菌属（Staphylococcus）以及假单胞菌属（Pseudomonas）这4种优势菌属与蛋白酶活性表现出正相关关系,而其他优势微生物属均与蛋白酶活性呈负相关关系。     

提高郫县豆瓣甜瓣子品质的工艺条件优化

以郫县豆瓣生产过程中分离到的米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus）为出发菌种,以感官评价和氨基酸态氮及综合酶活力为评价指标,筛选出功能米曲霉（Aspergillus oryzae）SICC3.1083和SICC3.930进行提高甜瓣子品质研究。通过单因素试验,筛选出混合种曲比例、发酵温度、盐分3个显著影响因素,采用响应面法优化混合种曲发酵工艺条件。结果表明,最佳发酵工艺为米曲霉SICC3.1083和SICC3.930质量比1.0∶1.0、发酵温度40 ℃、发酵时间25 d、盐分12%。在此优化工艺条件下,甜瓣子感官评分为88分,氨基酸态氮含量为0.78 g/100 g,比优化前分别提高了17%和20%,感官评分和理化指标均优于传统发酵工艺。     

发酵酱油豆豉中优势霉菌的筛选及功能分析

针对发酵过程中的霉菌进行筛选和鉴定,对发酵豆子中的微生物进行分离纯化,筛选出独特个体的霉菌,进行划线培养,再对初步挑选的霉菌进行筛选鉴定试验。霉菌通过测定蛋白酶活力、非产H_2S试验、非产生物胺试验等试验后得到4株优势菌株,通过镜检得出均为米曲霉(Aspergillus oryzae)。通过菌株的耐盐性、耐亚硝酸盐、生长曲线、抑菌性及氨基态氮试验对4株菌的性能进行测定,3号和6号米曲霉的耐盐性和耐亚硝酸盐性及蛋白降解能力较强,4号和7号米曲霉的活性和抑菌性较强。     

郫县豆瓣中高产α-淀粉酶米曲霉筛选鉴定及产黄曲霉毒素特性评价

α-淀粉酶在郫县豆瓣发酵过程中具有重要的作用,不仅能为郫县豆瓣中的微生物提供碳源,还能在微生物作用及化学反应下生成各类风味物质。豆瓣酱中黄曲霉毒素的污染是行业关注的问题,排除菌株产黄曲霉毒素的可能性,是筛选高效菌株的必要条件。从传统的豆瓣曲中筛选得到4株产α-淀粉酶活力较高的菌株,其中米曲霉30M-1发酵曲精的α-淀粉酶活力高达3 497 U/g,菌株16、FN、DM2发酵曲精的酶活力也可达到2 000 U/g。采用ITS(internal transcribed spacer identification)测序构建系统发育树,结合形态观察,研究菌株产黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)基因的表达及产AFB1的可能性。测定的结果显示,4株菌株与米曲霉同源性更近,没有造成AFB1污染的风险,说明所筛选的高产淀粉酶的霉菌具有提高豆瓣酱产品发酵效率的可能性。     

高蛋白酶活力米曲霉BL18在豆瓣酱制曲和发酵中的应用

米曲霉是豆瓣酱发酵常用菌株,蛋白酶活力是评价成曲的重要指标。蛋白酶能将豆瓣原料中的蛋白质降解为寡肽以及氨基酸,为豆瓣酱风味提供重要前体物质,所以提高米曲霉的蛋白酶活力显得尤为重要。米曲霉BL18是1株具有较高蛋白酶活力的米曲霉菌株,将它应用在豆瓣酱发酵过程并与米曲霉3.042进行比较,同时通过基因组测序挖掘差异背后的遗传基础。与米曲霉3.042相比,米曲霉BL18成曲的孢子数达到4.19×10⁸个/g干曲,酸性、中性和碱性蛋白酶活力分别提高52%、7.6%和45.6%;发酵前期米曲霉BL18蛋白酶具有优势,并且能将豆瓣酱鲜味氨基酸、甜味氨基酸总量分别提升33.3%和10.8%;基因注释结果表明米曲霉BL18具有强大的能量合成、蛋白质合成及次级代谢产物合成能力,相比于米曲霉3.042,在米曲霉BL18中发现647个特有基因。米曲霉BL18在制曲发酵过程表现出的优势性能及大量功能基因的注释为其在豆瓣酱发酵应用中提供了有力的理论基础。     

霉豆瓣中优势微生物蛋白酶活性测定

选择市售的2种霉豆瓣为研究对象,分离出其中的微生物,通过回接发酵实验,筛选出能发酵霉豆瓣的优势菌株M1、M2和M3。经鉴定M1为黑曲霉(Aspergillus niger)、M2为米曲霉(Aspergillus oryzae)、M3为雅致放射毛霉(Actinomucor elegant)。对优势菌株进行蛋白酶活力及氨基酸态氮含量测定。结果表明,米曲霉的中性蛋白酶和碱性蛋白酶活力最高,分别为632 U/g和416 U/g。黑曲霉产酸性蛋白酶活力及氨基酸态氮能力远高于米曲霉和毛霉,酸性蛋白酶高达872 U/g,氨基酸态氮含量高达0.997 5 g/100 g。而毛霉产的3种蛋白酶活力均在中间值,可起到一定的补充作用。     

豆瓣酱发酵种曲红曲霉LLMY-18的筛选分离

从麦芽汁培养基中利用籼米分离菌株,通过平板筛选和固体培养的方法,筛选分离获得一株优质、稳定、高产、周期适合的红曲霉菌株LLMY-18。此菌株在发酵周期和发酵条件方面与豆瓣酱所需的条件相似,产红色素的能力大大提高,可将其应用到豆瓣酱的加工生产中。初步表明,红曲霉LLMY-18参与发酵制成的红曲豆瓣酱具有色泽红润、口感醇厚、味道鲜美等优点。     

海南雪茄烟叶霉变微生物鉴定及拮抗菌株筛选

为明确引起海南雪茄烟叶霉变的微生物种类并筛选其拮抗菌株防治烟叶霉变,分别从海南霉变雪茄烟叶表面分离、纯化得到霉变微生物和拮抗微生物,采用形态学和分子生物学相结合的方法鉴定微生物种类。鉴定和筛选结果表明,引起海南雪茄烟叶霉变的微生物主要为篮状菌属、帚霉属和曲霉属,得到3株霉变菌株分别为Talaromyces funiculosus、Scopulariopsis brevicaulis和Aspergillus occultus。筛选到2株拮抗效果良好的拮抗菌株,分别为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和耐盐芽孢杆菌（Bacillus halotolerans）。引起海南雪茄烟叶霉变的微生物主要为篮状菌属、帚霉属和曲霉属菌株,筛选到的2株芽孢杆菌对致霉菌有良好的拮抗作用,为雪茄烟叶霉变的防治提供了参考。     

脱苦蛋白酶霉菌菌株的选育

从自然发酵的豆酱中分离得N3株蛋白酶高产菌株M1、M2、M3和供试的安全菌株毛霉、黑曲霉、栖土曲霉在各自的固、液体发酵培养基中培养，从中筛选出蛋白酶活力最高且蛋白酶液能脱除苦味肽苦味的菌株M3。根据M3菌株的菌落形态和菌体形态确定属于曲霉属。     

复合菌株共培养制曲改善郫县豆瓣成曲酶系活力

为改善郫县豆瓣成曲酶系活力,对传统酿造酱制品中高产蛋白酶霉菌进行分离鉴定,并以蚕豆瓣为原料,利用单一菌株和复合菌株共培养制曲,比较2种制曲方式主要酶活力。实验中分离到2株高产蛋白酶菌株QM-6和QH-3,经形态学和生物学鉴定分别为米曲霉(Aspergillus oryzae)和黑曲霉(Aspergillus niger)。米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培养制曲比单一菌株周期短,且豆瓣成曲曲香浓郁;利用复合菌株制曲,中性蛋白酶、碱性蛋白酶、氨肽酶比单一米曲霉制曲酶活力高,最高分别为1 532、1 164和151 U/g,酸性蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶活力最高分别为513、121和574 U/g,比单一米曲霉或黑曲霉制曲提高约1倍。综合制曲过程中的曲料菌丝、孢子、颜色、气味、质地等变化与酶活力比较,米曲霉QM-6和黑曲霉QH-3共培养复合制曲能有效提高蚕豆曲酶系活力,弥补单菌株制曲酶活力不足的缺陷,且成曲品质优良。     

郫县豆瓣加工过程中黄曲霉毒素B1的变化及关键控制点研究

采用酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒法测定豆瓣在加工过程中各关键环节样品（包括制曲过程、甜瓣子发酵、辣椒醅发酵和豆瓣酱的后熟期等阶段）的黄曲霉毒素B1（AFB1）含量的变化,探究影响AFB1含量的关键控制点,为以后降低豆瓣中AFB1含量的研究提供方向。测定结果表明,豆瓣制曲阶段AFB1含量变化不明显,在0～0.25 μg/kg范围内;甜瓣子发酵过程和豆瓣酱后熟阶段AFB1含量呈显著上升趋势,从甜瓣子发酵初期的0.175 μg/kg增加至1.09 μg/kg,最后到成熟豆瓣酱的2.63 μg/kg;辣椒醅阶段AFB1含量总体保持稳定,为0.80 μg/kg。由于AFB1含量从制曲后期到豆瓣酱的成熟总体呈上升趋势,且甜瓣子的发酵阶段与豆瓣酱的后熟期是控制豆瓣AFB1含量的关键点,应加强对相关操作及其环境的控制与管理。     

He-Ne激光和NTG复合诱变米曲霉提高其蛋白酶和淀粉酶酶活力

以分离自豆酱中的米曲霉(Aspergillus oryzae)HDF-C14为出发菌株,采用He-Ne激光和亚硝基胍复合诱变的方法获得高产蛋白酶和淀粉酶的突变株HDF-C14-HN5,并将其应用到豆酱发酵中,测定酱曲发酵时蛋白酶和淀粉酶的酶活力。所得成曲中干基蛋白酶酶活力最高可达1572.64U/g,淀粉酶酶活力最高可达2815.23U/g。此生产性发酵实验可以为该菌株投入工业化生产提供技术支撑。     

粟米酱米曲霉菌的分离、筛选与鉴定

反复纯化培养自然发酵的粟米酱中分离的野生丝状真菌，经形态学鉴定，确认其为米曲霉菌群的米曲霉菌。用福林-酚法测定其蛋白酶活力，并确定活力最高的菌株。实验表明选育优良的米曲霉菌株不仅要考察菌株的蛋白酶活力，也要考虑菌株孢子的比生长速率。     

发酵鸡血中优良菌株的筛选与鉴定

以发酵鸡血为原料,采用微生物法从中分离筛选出细菌60株、霉菌30株,对90株菌株进行透明圈试验、蛋白质含量、氨基酸态氮含量、可溶性蛋白质含量测定,再进行综合比较分析,最终筛选出发酵鸡血的优势菌株为细菌A7、A8,霉菌B1、B4,并通过形态学观察、细菌16SrDNA和霉菌28SrDNA对优势菌株进行分子鉴定,最终得到细菌A7为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),A8为希瓦氏菌(Shewanella sp.);霉菌B1为青霉菌属(Penicillium citreonigrum),B4为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。该实验的研究为畜产物等食品方面的开发和利用奠定理论基础。     

豆瓣辣酱高酶活霉菌筛选及豆醅促熟性研究

以豆瓣辣酱微生物区系中已分离鉴定的5株优势霉菌M2~M6为试验菌株,通过筛选高产蛋白酶和肽酶菌株,并将之应用于发酵豆醅,对比传统发酵以探索其在缩短周期、促进风味及提高品质等方面的应用可行性。研究表明:M3产蛋白酶活力达到139.49U/mL;M6肽酶活力达1.039mg/dL。采用高酶活菌株进行人工接种菌群强化发酵蚕豆,促熟效果显著,发酵时间缩短至20天(传统周期为60~90天),M3组呈味氨基酸含量达56.63%,M6组为48.03%,而传统优质CK组仅为45.23%,差异显著(P0.05)。     

发酵初期豆瓣酱中微生物多样性分析及产酶菌株的筛选

为了探明发酵初期(发酵70 d)豆瓣样品中微生物的多样性及产酶菌株对豆瓣风味的影响,采用纯培养的分离方法对分离菌株进行了细菌16S r RNA系统发育分析;同时用选择培养基对产中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、淀粉酶的菌株进行了筛选。结果表明,发酵初期豆瓣样品微生物种类丰富,总共分离得到80株菌株分属于11个属(Bacillus、Halomonas、Oceanobacillus、Virgibacillus、Lactobacillus、Pichia、Aspergillus、Candida、Wickerhamomyces、Enterobacter和Gracilibacillus)。筛选出的34株典型菌中,产中性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶的比例分别为21%,24%,38%和56%。     

基于ITS4/5 rRNA区序列对不同时期大曲中霉菌的分离与鉴定

利用大曲作为糖化发酵剂是中国传统白酒主要的工艺特点之一。大曲中的微生物组成十分丰富包括各种种类的霉菌、酵母以及细菌,这些复杂的微生物体系为白酒的发酵提供了必要的微生物、酶以及风味物质。其中霉菌作为酒类发酵生产中必不可少的微生物,在大曲发酵过程中能够分泌一些糖化酶和蛋白酶等多种酶类以及有机酸等多种代谢产物,对大曲质量好坏起着重要作用。为了探究大曲中霉菌功能,本文对不同时期大曲中分离的霉菌采用ITS4/5 rRNA区序列进行分析比对,共分离鉴定了193株霉菌,分属于13个种。主要为红曲(Aspergillus ruber),米根霉(Rhizopus oryzae),微小根毛霉(Rhizomucor pusillus),Rhizopus azygosporus,烟曲霉(Aspergillus fumigatus),嗜热子囊菌(Thermomyces lanuginosus),谢瓦氏曲霉(Aspergillus salwaensis),Aspergillus chevalieri,米曲霉(Aspergillus oryzae)等,并构建了M-L系统树。根据这些分离鉴定的结果初步探究出大曲生产过程中不同时期霉菌的组成和变化规律。这些结果为进一步研究中国传统白酒的酿造微生物奠定了一定的基础。