康氏木霉原生质体制备及再生条件研究

研究纤维素酶高产菌株康氏木霉原生质体制备及再生的适宜条件,为该菌细胞融合和诱变育种提供适宜的真菌状态。对影响原生质体形成和再生的各因素(菌龄、蜗牛酶浓度、酶解温度和时间、渗透压稳定剂的成分和浓度)进行试验比较。康氏木霉原生质体制备的最佳条件:菌龄22h,蜗牛酶浓度2.0%,酶解温度30℃,酶解时间2.5h,蜗牛酶溶液中的渗透压稳定剂为0.6mol/L NaCl,再生培养基中的渗透压稳定剂为0.8 mol/L蔗糖。可以获得细胞融合和细胞突变诱导所需的原生质体数量。并观察到原生质体的释放方式主要有2种:顶端释放和段端位释放;以一种方式进行再生。     

酒酒球菌SD-2a原生质体制备的研究

通过单因素和正交试验,研究了菌龄、酶浓度、酶解温度及渗透压稳定剂等因素对酒酒球菌原生质体制备及再生的影响.确定其制备与再生的最佳条件为:菌龄34h,酶浓度1mg/mL,酶解温度37℃,0.8mol/L KCI为渗透压稳定剂,再生培养基也添加0.8mol/L KCI,在此条件下,其原生质体形成率与再生率之积为10.65%.     

青稞酒曲中酿酒酵母与假丝酵母原生质体形成与再生条件的研究

本实验通过研究酶种类、菌龄、酶浓度及酶的作用时间、菌体预处理及渗透压稳定剂等不同因素对原生质体形成与再生的影响，得出了青稞酒曲酵母ZY2，ZY8原生质体制备和再生的最佳条件：酵母ZY2在菌龄为10h，0.1mol/LEDTA＋0.1%β-巯基乙醇为预处理剂作用10min；30℃下用1.5%的蜗牛酶酶解1h；酵母ZY8在菌龄为10h，0.1mol/LEDTA＋20mmol/L2-硫苏糖醇混合于蜗牛酶1.5%＋溶壁酶1%的酶解体系中，30℃下酶解1h；配制酶解液时渗透压稳定剂采用0.7mol/LKC1，在稀释及配制再生培养基时采用17%蔗糖的条件下，酵母ZY2形成率达94.15%，再生率达13.85%；酵母ZY8形成率达88.78%，再生率达23.02%。     

阿魏菇原生质体制备及再生条件的建立

以新疆阿魏菇为材料,研究菌龄、酶解时间、酶解液对阿魏菇菌丝原生质体产量的影响,同时还研究了不同渗透压稳定剂对原生质体再生的影响。结果显示,在0.6 mol/L KCl稳渗剂条件下,菌龄为8 d阿魏菇菌丝体(0.1 g)在0.8 mL混合酶解液中(1.5%离析酶+0.5%纤维素酶+2%溶菌酶)制备原生质体,35℃酶解3 h获得原生质体达5×106个/mL。原生质体再生结果显示,在0.8 mol/L蔗糖稳渗剂下,原生质体再生时间为16 d,其再生率可达0.6%。该文通过对阿魏菇原生质体分离和再生条件的研究,旨在从细胞水平上探索一条食用菌育种新途径,为发展和完善食用菌新菌株选育提供理论依据和技术借鉴。     

Mass Preparation and Regeneration Conditions of Protoplast from AspergiUus oryzae AS 3. 951 and RIB40

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是：以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是：以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。     

米曲霉3.951菌株与RIB40菌株高产原生质体的制备及再生条件的研究

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是:以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是:以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。     

基因组重排技术选育纤维素酶高产菌株

利用基因组重排技术对产纤维素酶菌株里氏木霉T306进行育种研究,考察原生质体制备、再生及融合条件的影响因素。研究表明,里氏木霉原生质体制备和再生的最佳条件是:3.5%溶壁酶,菌丝菌龄22 h,酶解时间4 h,酶解温度30℃,采用pH 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,以高渗筛选培养基为再生培养基,再生培养基中渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl。在此条件下,里氏木霉原生质体量达1.44×10~7个/m L,再生率为2.64%。融合试验结果表明,将紫外照射90 s和微波辐射200 s两种方式灭活的原生质体融合,在30%PEG、30 mmol/L Ca~(2+)、30℃条件下处理12 min,原生质体融合率达0.5%。经两轮基因组重排试验,获得一株遗传稳定,产酶能力较强的融合子G2-0832,其内切葡聚糖酶活力达86.40 U/m L,较出发菌株提高了57.08%。     

桦褐孔菌原生质体制备与再生

研究桦褐孔菌原生质体制备与再生条件。采用正交试验法确定复合酶比例,用单因素试验测定不同等渗液、酶解时间、桦褐孔菌菌龄、酶解温度、再生培养基对桦褐孔菌原生质体制备与再生的影响。结果表明：混合酶(纤维素酶5mg/mL、蜗牛酶15mg/mL、溶壁酶15mg/mL、崩溃酶15mg/mL)、菌龄为7d的菌丝,采用0.6mol/L MgSO4为渗透压稳定液,酶解温度35℃,酶解时间5.5h,有利于原生质体的制备。就原生质体再生而言,酶解时间为3.5h制得的原生质体,以MgSO4作为渗透压稳定液,以完全再生培养基(CYM)和麦芽酵母葡萄糖再生培养基(GYM)有利于原生质体再生,再生率最高为0.13%。     

茶树菇与鸡腿菇原生质体融合及再生

研究茶树菇与鸡腿菇原生质体制备、融合及再生。以菌龄4d 的菌丝体为原料,采用1% 果胶酶和1% 蜗牛酶混合酶液(体积比1:1),酶解4h,酶解温度为30℃,pH6.0 的0.6mol/L 甘露醇溶液为渗透压稳定剂,制备得到茶树菇与鸡腿菇原生质体。两种原生质体融合的最佳条件为：使用35% 聚乙二醇(PEG4000)和0.2mol/L CaCl₂ 溶液(pH10)为助融剂,30℃融合30min。利用灭活原生质体作为标记筛选出融合子,融合的细胞在培养基中实现再生,通过菌落表型的比较和拮抗实验验证再生出的为融合子。     

黑曲霉原生质体的制备、再生及转化条件

为了建立原生质体介导的黑曲霉转化系统，研究了菌龄、酶系统、渗透压稳定剂、酶解时间对葡萄糖淀粉酶生产菌株黑曲霉CICIMF0410原生质体形成与再生的影响。结果表明，培养4d的幼嫩菌丝体最适于制备原生质体；综合考虑原生质体形成与再生的情况，作者选用1mol／L山梨醇为最适渗透压稳定剂，1g／dL蜗牛酶-1g／dL纤维素酶-0．1g／dL溶壁酶为最适裂解酶组合，30℃酶解2．5～3h，最适合的原生质体的再生培养基为含0．6mol／LMgSO4的TZ培养基。在PEG和CaCl2存在条件下，以潮霉素B为选择性标记，质粒pBC-Hygro转化原生质体，每微克DNA可获得4～5个转化予。     

啤酒酵母原生质体制备与再生条件的筛选

试验正交设计方法,对啤酒酵母原生质体制备与再生进行了研究。试验表明:以静置培养12h的细胞,0.6mol/L KCl作为渗透压稳定剂,经EDTA-Na2+预处理,在2%蜗牛酶作用下,32℃酶解90min为条件获得最佳制备率,制备率为99%以上;以静置培养14h的细胞,0.6mol/L蔗糖作为渗透压稳定剂,不经过预处理,在1.5%蜗牛酶作用下,30℃酶解120min,涂布于山梨醇为渗稳剂的再生培养基中为条件获得最佳再生率,再生率为65%。     

双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究

对双亲灭活米曲霉原生质体融合育种中原生质体制备的条件进行了研究,将菌丝的预处理与细胞壁的酶解合为一步,并讨论了DTT的加入量。结果表明,原生质体制备的最佳破壁酶为纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶3种酶混合浓度比为5:3:1;菌丝培养15h;酶解时加入3mol/L DTT;酶解2.5h;0.8mol/L NaCl作为渗压稳定剂。所得双亲菌株原生质体的融合率为3.31%。     

冬虫夏草原生质体制备与再生条件的研究

采用正交分析方法,对影响冬虫夏草菌株原生质体制备与再生的主要因素进行研究。结果表明,最佳条件组合为培养3d 的菌丝体,在2.0% 溶壁酶+1.0% 蜗牛酶的酶液中,0.6mol/L 的KCl 作为原生质体制备的渗稳剂,0.6mol/L 的甘露醇作为再生培养基的渗稳剂,32℃酶解2h。在此条件下,原生质体得率可达到2.98 × 108/ml,再生率可达到42.09 × 10-2。     

灵芝原生质体诱变选育高产漆酶突变株的研究

对一株产漆酶活性较高的灵芝(Ganoderma.lucidumKarstNo.1)原生质体的制备、再生及紫外诱变育种进行了研究,获得了1株漆酶活性比对照菌株提高2.83倍的突变株G301。实验所确定的原生质体最佳制备条件为:以蔗糖为稳渗剂,采用4%(W/V)溶壁酶与2%(W/V)蜗牛酶等体积混合酶液,在30℃、pH6.0下,对液体培养48h的灵芝菌丝体酶解1h;同时实验所确定的原生质体诱变的适宜条件为:30W紫外灯距离40cm照射30s。     

红曲霉M9x的原生质体形成与再生条件的研究

对红曲霉M9x用混合酶制取原生质体及原生质体再生条件进行了探索。其原生质形成和再生最佳条件为:以豆芽汁培养液为菌丝培养基,采用60h菌龄的菌丝体,以0.6mol/LMgSO4作为渗稳剂,用1.5%混合酶(蜗牛酶:纤维素酶=7:3)在30℃处理2h,原生质体形成数可以达到1.61×107个/ml,再生率为8.49%。     

高产L-乳酸米根霉的原生质体制备与再生条件研究

为建立原生质体融合法选育高产L-乳酸米根霉(Rhizopus oryzae)菌株,对米根霉菌株原生质体制备及再生条件进行研究。考察酶种类、酶质量浓度、时间、温度、pH值、渗透压、预处理等因素对原生质体制得量及再生率的影响,获得原生质体制备及其再生的优良条件：不添加甘氨酸,渗透压稳定剂为0.6mol/L的NaCl缓冲液,按1.5mg/mL组合酶质量浓度,蜗牛酶、纤维素酶和溶壁酶质量浓度配比为1:1:1进行混合,35℃、pH6、酶解2h,可获得原生质体制得量最大为2.74×106个/mL,再生率最高为6.8%。