LPMO结合硫酸水解制备纤维素纳米晶体

以棉溶解浆为原料,使用裂解性多糖单加氧酶（LPMO）预水解结合硫酸水解制备纤维素纳米晶体（CNC）,对LPMO预水解前后纤维的微观形态和制得的CNC进行了粒径、结晶度和微观形态等表征,并与仅硫酸水解制备的CNC进行对比。研究发现,采用质量分数60%硫酸水解时,经LPMO预水解得到的CNC比仅硫酸水解制备的CNC平均粒径减少22 nm,结晶度提高8.8个百分点,得率提高19.3个百分点。在LPMO预水解后,随着硫酸质量分数降低,CNC的得率和羧基与磺酸基总量减少,粒径上升,而结晶度无明显正比关系。从LPMO作用整体效果来看,预水解结合50%硫酸得到的CNC与对照组相比粒径增加9 nm,羧基和磺酸基总量略小,而结晶度提高6.4个百分点,得率提高18.4个百分点,其原子力显微镜（AFM）表征显示已达到纳米水平。故通过LPMO预水解结合50%硫酸即可制得CNC,这可降低对工业生产上设备耐酸能力的要求。但LPMO反应周期长,因此在实际工业应用中有待进一步研究。     

黑曲霉 G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆与序列分析

从黑曲霉Aspergillus niger G-1125克隆到了生淀粉糖化酶菌基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明,该生淀粉糖化酶基因组DNA 序列编码区长2 172 bp,cDNA编码区长1 923 bp,该基因含有4个内含子,共编码640个氨基酸,前18个氨基酸为信号肽序列,该氨基酸序列中共含有2个潜在的糖基化位点,软件预测出该酶的分子质量约为68 ku,等电点为pH值4.07。     

植物乳杆菌DMDL 9010胞外多糖合成蛋白cpsB的生物信息学分析

为了探讨植物乳杆菌DMDL 9010胞外多糖合成蛋白cpsB的结构特性,该文通过生物信息学技术研究了胞外多糖合成蛋白cpsB的理化性质、亲/疏水性、跨膜结构、功能位点、磷酸化位点、信号肽、结构域、保守功能域、序列同源性以及空间结构进行预测与分析。结果表明胞外多糖合成蛋白cpsB相对分子质量约为2 920,等电点6.86,含有191个氨基酸;其为疏水蛋白,具有较高的稳定性;经过跨膜结构预测,发现其不存在跨膜结构,为胞内蛋白;胞外多糖合成蛋白cpsB中含有15个磷酸位点;氨基酸序列中不包含信号肽,所编码蛋白均为内分泌型蛋白;保守功能域预测中,基因中仅发现一段PHP结构域,该基因可能参与调节胞外多糖的基因表达。胞外多糖合成蛋白cpsB的二级结构中α-螺旋占51.14%,并不存在β-折叠和β-转角结构,其三级结构比例与二级结构基本相似。该研究对植物乳杆菌DMDL 9010的胞外多糖合成蛋白cpsB功能机制进行深入研究,对利用基因工程技术研究其胞外多糖的生物合成具有重要意义。     

几丁质裂解性多糖单加氧酶的表达及应用研究

以具有几丁质降解能力菌株Chitiniphilus sp. LY72的裂解多糖单加氧酶（CsLPMO）为研究对象，在克隆CsLPMO全长基因的基础上对其进行生物信息学分析，利用3种表达质粒pET-22b、pET-28a和pCold，构建CsLPMO异源表达菌株EBL-22、EBL-28和EBL-Co。重组CsLPMO蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，筛选最佳表达质粒，对其表达条件进行优化。结果表明，CsLPMO是一种裂解性多糖单加氧酶，隶属于AA10家族。3株重组菌中，纯化重组酶蛋白相对含量分别为5.9%、4.1%、5.4%，比酶活力分别为155.42 U/mg、80.26 U/mg、148.29 U/mg，因此，确定最佳质粒为pET-22b，菌株EBL-22表达条件为：OD600 nm值至0.4时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4 mmol/L后，在25 ℃下诱导表达16 h。在优化条件下，其可溶性蛋白含量为928.32 mg/L，比酶活力为3.34 U/mL。CsLPMO的加入可使还原糖的产量提高1.67倍。     

大肠杆菌分泌表达裂解性多糖单加氧酶发酵条件的优化

裂解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenases,LPMOs)是一种铜离子依赖型的氧化酶,可以降解生物质中的顽固多糖。因此,LPMOs在木质纤维素转化为生物燃料或其他有价值的寡糖方面得到了广泛的研究。该研究对来源嗜热毁丝霉的MtC1 LPMO在大肠杆菌中进行了异源表达,首先研究了不同信号肽对重组蛋白表达的影响,结果表明PelB信号肽可以成功将MtC1 LPMO分泌至细胞外,提高了MtC1 LPMO的总可溶性蛋白含量。为进一步提高MtC1 LPMO胞外表达量,对诱导时期、诱导剂浓度、诱导温度、发酵时间和乙醇浓度进行了优化。实验结果表明,在培养基OD 600值达到0.9时,添加终浓度为0.5 mmol/L的IPTG和终体积分数为2%的乙醇,然后于30℃发酵16 h后重组MtC1 LPMO的表达量最高,可溶性蛋白总含量为12.65 mg/L,为优化前的2.05倍。其中细胞外蛋白含量也达到了最高,为8.51 mg/L,细胞外比率为67.30%,以2,6-二甲氧基苯酚为底物在标准条件下测定的比活力为10.3 U/g。     

米曲霉A-F04的β-果糖基转移酶基因的克隆鉴定及其生物信息学分析

以实验室前期筛选出的高产β-果糖基转移酶（β-fructosyltransferase,β-FTase）的米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株A-F04出发,提取米曲霉A-F04基因组DNA和RNA,采用PCR和RT-PCR技术克隆β-FTase基因,得到β-FTase基因完整编码序列和内含子序列,利用重组技术构建β-果糖基转移酶质粒基因库,并构建基因的进化树,预测β-FTase分子量、等电点、氨基酸组成等物化性质,预测其N-糖基化位点和信号肽,运用SWISS-MODEL对β-FTase的三级结构预测。结果显示,成功鉴定出菌株A-F04具有β-FTase基因;菌株A-F04的β-FTase基因编码区长度为1630 bp,含有一个52 bp的内含子,位于173 bp与224 bp之间;编码序列的开放阅读框总长为1578 bp;软件分析得知β-FTase为亲水性的稳定蛋白,其分子量为57.4653 ku,理论等电点为4.83,由525个氨基酸组成;可能的N-糖基化位点有6处;信号肽分析软件得知其编码的1¹7位置处的氨基酸为信号肽;SWISS-MODEL构建的3个模型质量较高,有利于后期对β-FTase的结构和功能的研究。      

亚硝酸还原酶基因克隆、表达与纯化

该研究通过聚合酶链反应（PCR）方法从木糖氧化产碱菌（Achromobacter xylosoxidans DL-1）基因组DNA中成功克隆含铜亚硝酸还原酶基因。PCR测序表明该基因全长1083个核苷酸,编码360个氨基酸,预测其理论分子质量约38.924 k Da,等电点（p I）4.83,命名为Cu NiR（Genbank登录号KX674378）。结构域分析该蛋白编码区包含信号肽,1个铜离子结合位点,1个氧化还原酶催化域。将Cu NiR基因构建到p ET22b载体,并转化至大肠杆菌（Escherichia coli,E.coli）BL21（DE3）中诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示目的蛋白可溶表达。利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,酶活检测显示比活力为123.82 U/mg,为后期含铜亚硝酸还原酶（Cu NiR）的生化性质表征奠定理论基础。      

多糖奈瑟球菌中淀粉蔗糖酶基因的克隆及表达载体的构建

根据不同类型的奈瑟氏球菌中的淀粉蔗糖酶（amylosucrase）基因的保守序列设计引物,通过TD—PCR扩增的方法克隆出多糖奈瑟球菌ATC043768基因组中编码淀粉蔗糖酶的基因Ams2,将其与pMD～18T载体连接,得到重组质粒T—Ams2。序列测定及生物信息学分析结果表明,Ams2基因由1911个碱基组成,编码6j7个氨基酸,Ares2与多糖奈瑟球菌ATCC85322菌株的同源性达g6％,对应的氨基酸同源性为97％。将该基因插入表达质粒pET-28a中,构建重组质粒pET28a～Ares2,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。     

树莓RiPAL1基因克隆及生物信息学分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase,PAL）是苯丙烷类代谢的关键酶,能调节树莓中黄酮类的生物合成。为了深入研究树莓中RiPAL1基因的功能与调控机制,以树莓果实为材料提取总RNA,合成cDNA第一链,然后成功克隆出树莓果实RiPAL1基因,并对其进行了相关的生物信息学分析。结果表明,RiPAL1基因的编码序列（Coding Sequence,CDS）全长为2 133 bp,编码710个氨基酸,分子量为77.50 ku,等电点为6.21。RiPAL1蛋白疏水性最大值为4.50,最小值为-4.50,平均疏水指数为-0.49,为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽。含有4个N糖基化位点和67个特异性激酶位点,二级结构以α螺旋为主,三级结构为同型四聚体。多序列比对显示RiPAL1蛋白具有典型的苯丙氨酸解氨酶保守结构域,系统进化分析表明RiPAL1蛋白与同科植物草莓亲缘关系最近。该研究可为深入研究RiPAL1基因参与树莓果实黄酮类物质生物合成的分子机制提供参考。     

不同品种马兰的活性组分及抑制蛋白糖基化功能

选取10 个品种马兰（M1～M10）为研究对象,测定M1～M10的β-胡萝卜素、多酚、黄酮和皂苷的含量;并初步分析10 个品种马兰抑制蛋白糖基化的活性及其与各功能成分之间的关系。结果表明：马兰中的活性成分含量较高,其中M2、M5的β-胡萝卜素含量最高;M3、M10的多酚和黄酮含量最多;M4、M6的皂苷含量最高。10 个品种马兰粗提物具有良好的抑制蛋白糖基化效果,抑制率达到49%～71%。马兰对由甲基乙二醛（methylglyoxal,MGO）和乙二醛（glyoxal,GO）引发的蛋白质的非酶糖基化反应的抑制作用与其多酚含量和黄酮含量呈现一定的线性关系;而皂苷含量仅与对MGO引起的非酶糖基化反应的抑制作用呈现一定的线性关系。     

大蒜多糖提取及其组成测定

大蒜籽经过正己烷脱脂、热水提取和Sevag 法脱蛋白后,用乙醇沉淀得大蒜多糖,采用响应面法对大蒜多糖提取条件进行优化,采用薄层层析和红外光谱法对大蒜多糖主要成分进行分析。结果表明：大蒜多糖最佳提取工艺为提取温度75.3℃、提取时间2.25h、料水比1:30g/ml、提取1 次,在此条件下,多糖实际提取率为61.45%。大蒜多糖是一种以果糖为主的杂果聚糖。     

芽球菊苣根粗多糖提取工艺优化及其体外抗氧化活性和相对分子量分析

目的:以印度芽球菊苣根为原料优化粗多糖的提取工艺,测定其抗氧化性及相对分子量。方法:考察料液比、水浴温度和水浴时间对菊苣根粗多糖得率的影响;采用Box-Behnken结合Matlab分析法优化粗多糖热水浸提法提取工艺;测定所提菊苣根粗多糖体外羟自由基清除能力和还原力;纯化后分析中性糖和酸性糖的平均相对分子量。结果:经过单因素和Box-Behnken设计优化试验,得到最佳提取工艺为:料液比2.74:100 g/mL,水浴温度72 ℃和水浴时间165 min,此时菊苣根粗多糖得率的理论预测值为40.32%,经验证实际值为39.99%±0.43%,与预测值差异不显著（P>0.05）;经Matlab分析,当提取时间取较高值（C=165 min）,料液比2.4:100～3.1:100 mL/g,水浴温度70～74 ℃,粗多糖得率可以取得较大值。按照上述最优工艺所提菊苣根粗多糖具备羟自由基清除能力（IC₅₀值为1.36 mg/mL）和Fe3+还原力（3 mg/mL对应吸光值0.21）,且与浓度呈现正相关。此外,采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）测得菊苣中性糖和酸性糖峰型良好,酸性糖峰高且窄表现出较高的纯度,中性糖和酸性糖平均相对分子量分别为10072.07和2388.13 Da。结论:Box-Behnken优化法结合Matlab分析法优化菊苣根粗多糖提取工艺切实可行,所提粗多糖不仅高得率,也兼具良好的体外抗氧化能力,其中,酸性糖纯度较高,中性糖分子量较大。     

响应面优化超声协同高压矩形脉冲电场提取黄花菜多糖工艺及其抗氧化活性研究

以黄花菜为原料,采用超声协同高压矩形脉冲电场提取黄花菜多糖,在单因素实验的基础上,利用响应面分析法优化超声协同高压矩形脉冲电场提取黄花菜多糖工艺,同时测定黄花菜粗多糖对·O₂^-、·OH以及DPPH·的清除能力。结果表明,超声协同高压矩形脉冲电场提取最佳工艺条件为:提取时间30 min,提取温度59 ℃,超声功率700 W,电场电压 14 kV,得到的黄花菜多糖得率为10.03%,此结果接近预测得率,表明提取工艺是可行的。体外抗氧化活性结果表明,黄花菜粗多糖有一定的清除能力,且与多糖浓度呈正相关,当黄花菜粗多糖浓度为1.0 mg/mL时对·O₂^-、·OH以及DPPH·的清除能率分别可达到66.93%、70.61%、49.28%。本研究为黄花菜多糖提供了一种新型的提取工艺。     

响应面优化龙胆多糖的提取工艺及抗氧化性研究

该研究优化了龙胆草多糖的提取工艺,并对其体外抗氧化活性进行了评价。在单因素试验的基础上,选择醇沉浓度,提取温度,提取时间,液料比为考察因素,以龙胆草多糖提取率为响应值,应用Box-Behnken试验进行四因素三水平设计,采用响应面法来优化龙胆草多糖的提取工艺。并评价龙胆草多糖清除DPPH·﹑ABTS+·﹑OH·﹑O2-·作用以及总还原能力。结果表明,龙胆草多糖的最佳提取工艺为醇沉体积分数为90%,提取时间为2 h,液料比为26∶1（mL∶g）,提取温度为75 ℃;龙胆草多糖的实际提取率为（5.89±0.25）%,与预测值相比,偏差较小。龙胆草多糖有一定的抗氧化活性,但活性均小于同浓度的维生素C。     

黄粉虫多糖响应面法提取及抗氧化活性

采用响应面分析法研究黄粉虫多糖提取的工艺条件,同时检测提取多糖的抗氧化活性。通过对关键影响因子的最佳水平范围的研究,依据回归分析确定了黄粉虫多糖最佳提取条件为:提取温度90℃、液固比12、提取时间158 min,在此条件下黄粉虫多糖提取率的理论值为1.99%,实测值为1.94%。分析表明,黄粉虫多糖主要由葡萄糖组成,并含少量甘露糖和半乳糖。体外抗氧化试验显示,黄粉虫多糖具有一定的抗氧化作用,可作为潜在的天然抗氧化剂来源。     

蛹虫草多糖的亚临界水萃取及其抗氧化活性研究

以蛹虫草为原料,通过单因素和响应面分析实验对亚临界水提取蛹虫草多糖的工艺条件进行优化并对所得到的多糖进行结构鉴定和抗氧化活性测定。结果表明,优化得到的最佳提取条件为:p H为8,提取温度180℃,水料比为21∶1（m L/g）,萃取时间为13 min时,萃取得率为7.13%,与传统热水浸提法相比,亚临界水浸提法在提取得率和提取时间方面均具有明显的优势（传统热水浸提法分别为1.72%,180 min）。传统热水浸提法和亚临界水浸提法得到的蛹虫草多糖均具有一定的还原能力,并且其DPPH·清除作用的IC₅₀值分别为0.324、0.314 mg/m L。红外光谱分析表明热水浸提和亚临界水浸提得到的蛹虫草多糖具有相同的结构特征。      

百香果果皮多糖提取工艺优化及其抗氧化活性研究

本文研究百香果果皮多糖的提取工艺条件及果皮多糖体外抗氧化活性。采用超声波提取方法,以百香果果皮多糖得率为响应值,在单因素实验基础上,优化液料比、超声功率、超声时间、超声温度等条件,得到最佳提取工艺:液料比为49:1(mL/g),超声温度69℃,超声时间15 min,超声功率105 W,多糖平均得率为5.890%,与预测值(6.09%)接近。体外抗氧化活性分析结果表明:当多糖浓度为2 mg/mL时,多糖对DPPH和羟自由基的清除能力分别为32.8%和59.0%,还原能力吸光值为0.34,较维生素C弱。研究成果将为百香果皮多糖的进一步研究及新产品开发提供理论指导。     

Cadmium uptake by a green alga can be predicted by equilibrium modelling

Short-term uptake of cadmium by a wild-type (2137) and a cell wall-less strain (CW-2) of Chlamydomonas reinhardtii was examined as a function of Cd speciation in a well-defined, aqueous medium. Internalization fluxes were determined for free cadmium concentrations ranging from 5 x 10(-10) M to 5 x 10(-4) M in the presence of ligands forming both labile and inert hydrophilic complexes. A first-order biological internalization, as predicted by the free ion activity model (FIAM), was observed for both strains. The maximum Cd internalization flux, Jmax, for the wild-type strain was 5-fold higher (1.3 x 10(-11) mol cm(-2) min(-1)) than for the CW-2 strain (2.3 x 10(-12) mol cm(-2) min(-1)) and was not influenced by the presence of competitors such as Ca in the experimental solution. The conditional stability constant for the adsorption of Cd to transport sites of the CW-2 strain was 5-fold higher (10(6.7) M(-1)) than for the wild-type strain (10(6) M(-1)). Competition experiments demonstrated that Mo, Mn, Cu, Co, Zn, Ni, Ca, and Pb inhibited, at least partially, Cd uptake, while no inhibition was observed for similar concentrations of Mg and Fe. The stability constant for the competitive binding of Ca to the Cd transport site was determined to be 10(4.5) M(-1). Cu and Zn competed with Cd uptake sites with stability constants of 10(5.6) and 10(5.2) M(-1), respectively. Protons also appeared to compete with Cd uptake sites as uptake could generally be predicted quantitatively in their presence. Finally, in the presence of low concentrations (<20 mg L(-1)) of Suwannee River fulvic acid, Cd internalization fluxes could be predicted from [Cd2+], in accordance with the FIAM.     

超声波协同酶法提取菊苣根多糖工艺优化

目的:优化超声波协同酶法提取菊苣根多糖的工艺条件。方法:采用中心组合设计方法（Box-Behnken Design）,建立以超声温度、超声时间、加酶量、酶解时间和液料比对菊苣根多糖得率的影响的二次回归模型。结果:菊苣根多糖提取的最佳工艺条件为超声温度45℃、超声时间35 min、加酶量1.6%、酶解时间1.8 h、液料比44∶1（m L/g）,在此条件下,菊苣根多糖的得率为46.75%,与预测得率47.71%接近。结论:该回归模型有极显著性,可以作为菊苣根多糖提取工艺的回归分析和参数优化。