纳豆枯草杆菌的筛选和纳豆激酶发酵条件优化

纳豆激酶是由纳豆枯草杆菌产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶.针对目前常用菌株的产酶活力较低、不能完全满足要求的问题,采用酪蛋白平板初筛摇瓶复筛的筛选策略,从纳豆中筛选获得了一株高产纳豆激酶的菌株,该菌株在筛选培养基上进行摇瓶培养,发酵液中纳豆激酶的酶活达到970 IU/mL.用Plackett Burman方法对影响液体发酵的各因素的效应进行了评价,并筛选出了有显著效应的四个主要因素:胰蛋白胨浓度、种龄、发酵温度和Na2HPO4浓度;在此基础上,用最陡爬坡路径逼近最大产酶条件区域;最后通过中心组合实验及响应面分析优化了纳豆枯草杆菌液体发酵的条件.通过在初始发酵条件和优化发酵条件下的对比研究,液体发酵液中纳豆激酶浓度从1 005 IU/mL提高到1 314 IU/mL,表明响应面法优化可成功地用于纳豆枯草杆菌液体发酵的条件优化.     

产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵条件的响应面优化

采用实验室前期构建的能够高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株,对其液体发酵条件进行优化。通过单因素实验和响应面Box-Behnken模型优化液体发酵培养参数,五因素三水平的响应面分析表明最佳发酵培养条件为:蛋白胨26.05 g/L,葡萄糖29.29 g/L,MgSO4 1.5 g/L,CaCl2 0.74 g/L,NaCl 10 g/L,pH 9.0,接种量3 %。在最优发酵培养条件下,纳豆激酶最高酶活达到2 186.17 IU/mL,比优化前提高了269 % ,这表明响应面法优化枯草芽孢杆菌工程菌能够明显的提高纳豆激酶活性,为该菌株规模化生产纳豆激酶提供了基础应用参考。     

纳豆芽孢杆菌菌剂的制备工艺

采用单因素及正交试验对纳豆芽孢杆菌发酵培养基、pH、温度、发酵时间等条件进行了考察,利用喷雾干燥法制备菌剂,考察了β-环糊精、蔗糖、可溶性淀粉及脱脂奶粉作为保护剂对菌剂制备的影响,并研究了储藏时间及条件对菌剂发酵活力的影响.研究结果表明:纳豆芽孢杆菌发酵培养基为黄豆浸汁培养基:黄豆以5倍水体积浸泡8~14h,121℃~126℃,0.1~0.15MPa处理1h,滤除黄豆,取豆水,加入5%的葡萄糖和0.02%的K2HPO4,调节pH至7.0;最优发酵工艺:初始pH7.0,37℃发酵10h;喷雾干燥最佳保护剂为5%脱脂奶粉;菌剂4℃冷藏180d以内不影响发酵活力.上述工艺下所制得的纳豆芽孢杆菌菌剂活菌数为6.5×108 CFU/g,发酵生产纳豆激酶性能良好.发酵生产纳豆激酶酶活为2 000~2 200IU/g.本研究为纳豆芽孢杆菌菌剂制备提供了一条较为合理的工艺路线.     

以豆粕为原料固态发酵产纳豆激酶工艺的优化

以食品级豆粕为唯一培养基成分,通过纳豆芽孢杆菌固态发酵产纳豆激酶的培养基的优化实验,确定优化条件为：接种量5%,装量为40,g于250,mL锥形瓶,培养基含水量60%,浸泡水pH,7.5,发酵温度37,℃.在培养24,h后达到产酶高峰,产酶活力达到1,662,FU/g.比较了在相同的发酵条件下,以食品级豆粕为培养基比大豆为培养基获得的酶活力和活菌数,都高出50%左右.     

纳豆芽孢杆菌的诱变育种研究

通过实验研究了纳豆芽孢杆菌的育种方法,对初始纳豆芽孢杆菌进行了紫外及微波诱变,采用牛奶-琼脂板筛选菌种,得到了目的菌株QBNW467.研究表明,采用牛奶-琼脂板法筛选诱变后的纳豆芽孢杆菌方法可行,用该法筛选出的菌株QBNW467的固体发酵产酶活性可达2200 IU.g-1.     

基于响应面法对枯草芽孢杆菌WB600-eg2发酵产内切葡聚糖苷酶条件的优化

出发菌株枯草芽孢杆菌WB600-eg2是通过分子生物学手段构建的重组菌,内切葡聚糖苷酶酶活为1.174IU/mL.本文通过响应面法对装液量、初始pH、接种量、转速、酵母粉添加量等发酵条件进行优化,得到最优发酵条件为装液量55mL/250mL、初始pH7.2、接种量10%、转速170r/min、酵母粉添加量0.4%.在此发酵条件下测得内切葡聚糖苷酶酶活为1.573IU/mL,比未优化条件下提高了33.9%.     

纳豆枯草杆菌的分离鉴定及发酵条件优化

从日本食品纳豆样品中,分离得到11株具有纤溶酶活性的产酶菌株,对其中酶活力最高一菌株N 06进行菌落形态、菌体形态及生理生化特性鉴定,鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌。并对该菌株进行液体发酵研究,优化了N 06菌株的最佳液体发酵培养基的碳源、氮源以及碳氮比的组成,即葡萄糖1.5%,蛋白胨1.5%,碳氮比1∶1。     

纳豆发酵过程中纳豆激酶及活性物质的变化

研究纳豆菌在脱脂大豆发酵过程中,对健康很有益的纳豆激酶和大豆活性物质--大豆异黄酮的变化.结果显示纳豆菌在脱脂大豆固态发酵中,发酵初始pH为8.0,水分质量分数为70%时,在37 ℃发酵48 h,产纳豆激酶活力最高;固态发酵条件为发酵初始pH为7.0～9.0,水分质量分数80%时,40 ℃发酵48～96 h,原料中大部分大豆异黄酮苷转化为大豆异黄酮苷元.     

纳豆枯草杆菌的分离鉴定及发酵条件优化

从日本食品纳豆样品中，分离得到11株具有纤溶酶活性的产酶菌株，对其中酶活力最高一菌株N-06进行菌落形态、菌体形态及生理生化特性鉴定，鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌。并对该菌株进行液体发酵研究，优化了N-06菌株的最佳液体发酵培养基的碳源、氮源以及碳氮比的组成，即葡萄糖1．5％，蛋白胨1．5％，碳氮比1：1。     

纳豆发酵过程中纳豆激酶及活性物质的变化

研究纳豆菌在脱脂大豆发酵过程中,对健康很有益的纳豆激酶和大豆活性物质——大豆异黄酮的变化。结果显示:纳豆菌在脱脂大豆固态发酵中,发酵初始pH为8.0,水分质量分数为70%时,在37℃发酵48 h,产纳豆激酶活力最高;固态发酵条件为:发酵初始pH为7.0~9.0,水分质量分数80%时,40℃发酵48~96 h,原料中大部分大豆异黄酮苷转化为大豆异黄酮苷元。     

重组纳豆激酶工程酵母菌发酵研究

利用在纤维蛋白平板法基础上进行改造的纤维蛋白原—琼脂糖平板法,筛选具有纳豆激酶活性的基因工程酵母菌。并用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶纤溶活性。通过甲醇诱导从近100个菌落中筛选出5株纳豆激酶活性较高的重组纳豆激酶工程菌。同时确定了重组纳豆激酶酵母菌的最佳甲醇诱导浓度2%,产酶高峰时间为96h。     

饲用芽孢杆菌混菌发酵产中性蛋白酶的工艺优化

为提高饲用芽孢杆菌中性蛋白酶的发酵单位,考察了多种芽孢杆菌混菌发酵产蛋白酶的协同作用效果,并在单因素试验的基础上,先后采用部分析因设计、爬坡设计及中心组合设计的试验方法对菌株配伍方式及发酵培养基组成进行了优化.通过优化构建了合适的混菌发酵体系,即芽孢杆菌A1、B1、B3菌株的混合比例为2∶3∶3;最佳发酵培养基组成(g/L)为:麦芽糖58.5、酵母膏28.6、麸皮42.5、吐温80 3.0、K2HPO43.0、CaCO33.0.在优化条件下,芽孢杆菌混菌发酵产中性蛋白酶活力单位可达到6 728 U/mL,较优化前芽孢杆菌A1的发酵活力单位提高了175.6%.     

响应面法优化芽孢杆菌LJ-7发酵产酯酶条件

为了获得海洋芽孢杆菌LJ-7发酵产酯酶的最佳条件,采用响应面法对其发酵条件进行了优化。首先,通过单因素试验选出对酯酶产量影响较显著的3个因素,即发酵温度、初始pH和发酵时间。在单因素试验的基础上,采用Box-Benhnken中心组合方法进行三因素三水平的试验设计,以酶活为响应值,利用响应面分析法进行进一步优化,确定最佳发酵条件为:发酵时间42.81h,发酵温度29.40℃,pH为6.21,此时预测的酯酶酶活为24.91 U/mL。在此最佳条件下,平行试验测得实际酶活为24.63U/mL,达到理论预测值的95%以上。该模型较好地预测了实际发酵情况,得到的优化条件具有实际应用价值。     

重组纳豆激酶工程酵母菌发酵研究

利用在纤维蛋白平板法基础上进行改造的纤维蛋白原一琼脂糖平板法，筛选具有纳豆激酶活性的基因工程酵母菌。并用纤维蛋白平板法测定纳豆激酶纤溶活性。通过甲醇诱导从近100个菌落中筛选出5株纳豆激酶活性较高的重组纳豆激酶工程菌。同时确定了重组纳豆激酶酵母菌的最佳甲醇诱导浓度2％，产酶高峰时间为96h。     

微杆菌Z4产几丁质酶的发酵条件研究

为提高微杆菌Z4发酵的几丁质酶得率,利用摇瓶研究了发酵温度、初始pH、装液量等对于发酵产酶的影响.在这些实验的基础上,运用正交试验对Z4产几丁质酶的摇瓶发酵条件进行了进一步优化.结果的极差分析和方差分析表明温度对产酶的影响最大,具有显著性.最佳摇瓶发酵工艺条件为:培养温度28℃,培养基初始pH7,接种量6%,三角瓶装液量60mL培养基/250 mL三角瓶.在该条件下发酵液酶产量达到4.13 U/mL,比优化前提高了79.6%.     

几株纤维素酶产生菌的分离鉴定及其产酶能力

从枯枝、秸秆、土壤中分离出35株产纤维素酶菌株。以酶活值作为复筛标准,筛选出5株产羧甲基纤维素酶和滤纸酶活力相对较高的菌株,分别为柱隔孢霉（Ramularia NS1）、康氏木霉（Trichoderma koningii NS2）、灰绿青霉（Penicillium glaucum NS3）、白腐菌（White-rot fungi NS4）和绿色木霉（T.viride Persex Fx NS5）。经？瓶发酵和酶活检测,其羧甲基纤维素酶活（CMC酶活）分别为297.97 IU/mL,300.11 IU/mL,154.83 IU/mL,146.68 IU/mL,308.14 IU/mL;滤纸酶活（FPA酶活）分别为6.56 IU/mL,5.63 IU/mL,4.29 IU/mL,9.63 IU/mL,8.02 IU/mL。其中绿色木霉（T.viride PersexFxNS5）在发酵条件：麸皮：CMC-Na（1：1）各6 g/L,硫酸铵4 g/L,发酵温度30℃,发酵时间3 d,发酵液CMC酶活和滤纸酶活分别达到352.11 IU/mL和13.96 IU/mL,比初筛酶活分别提高14.26%和74.06%。     

响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素G酰化酶

利用响应面法优化重组枯草芽孢杆菌pAUB-BmPGA／BS168发酵生产青霉素G酰化酶的条件。通过Plackett-Burman设计法对碳源、氮源、无机盐、温度等19个因素对发酵产青霉素G酰化酶的影响进行评价。筛选出发酵温度和酵母膏为影响产酶的显著因素。采用了中心组合设计实验对两种显著影响因素进行了优化,应用响应面分析确定了显著因素的最佳水平。结果表明,当温度为34℃,酵母膏为8．8g／L时,最终的酶活达到28．2U／mL,比初始发酵条件提高了1．19倍。在最佳条件利用15L的发酵罐对重组枯草芽孢杆菌进行扩大培养,最终酶活可达51．0U／mL,相对于摇瓶发酵又有大幅度的提高。     

调味纳豆食品开发及工艺计算探讨

探讨了利用纳豆菌发酵法生产风味纳豆的工艺过程及物料衡算.基本生产参数为:种子液37℃下培养16 h,大豆加3倍水浸泡12 h,沥干,121℃蒸煮20 min,接种量为4%(w/w),37℃发酵24 h,经后熟即得成品.在适宜发酵条件下,对大豆进行了风味调制,并以黑豆、豇豆等为原料进行了对照试验.研究证实,调味纳豆中的纳豆激酶活力降低很少,可以大批量生产,结合物料衡算,初步设计了小型纳豆加工厂的工艺路线及可行性方案.     

产β-甘露聚糖酶菌株的筛选及产酶条件优化的研究

本实验用培养基透明圈法从7种芽孢杆菌中筛选到酶活最高的三株芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌4.37、高龙枯草芽孢杆菌w-031 3.83、地衣芽孢杆菌3.83)。用测定发酵液酶活的方法进行菌株的复筛,酶活最高的菌株为枯草芽孢杆菌。对该菌产酶条件进行了单因素实验发酵条件的优化,最优产酶条件为:最佳碳源是魔芋粉,含量为4%,最佳有机氮源为酵母浸粉,最佳无机氮源为硝酸钠,最佳产酶时间为36 h。     

低能N+离子注入诱变选育琼胶酶高产菌株

对产琼胶酶的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)菌株WL进行N+离子注入诱变,寄以筛选获得高活力琼胶酶产生菌株.首先考察了N+离子注入剂量对类芽孢杆菌WL存活率的影响,在注入能量为10 keV的条件下,类芽孢杆菌WL菌株最佳剂量范围为15.6×1014～23.4×1014 ion/cm2.在23.4 × 1014 ion/cm2诱变剂量下,筛选得到1株高产琼胶酶的菌株WL-15,酶活力达到47.3 U/mL,较出发菌株提高53.6％,该菌株经5次传代培养,产酶活力稳定.之后优化了产酶培养基中的主要成分,在琼胶、NaNO3和NaCl的质量浓度分别为2.5 g/L,6.0 g/L,15.0 g/L时,类芽孢杆菌WL-15产酶活力达到了53.3 U/mL.