肉桂、石韦内生真菌的分离纯化及抑菌性研究

<正>采用组织块分离法从肉桂(Cinnamomum cassia Pres1)、石韦(Pyrrosia lingua(Thunb)Farwell)组织中分别分离得到7、24株内生真菌,以大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎球菌(diplococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为供试菌种,对所有肉桂     

产银杏内酯内生真菌的分离与鉴定

利用组织块培养法从健康的银杏根、茎中分离得到116株内生真菌。通过高效液相色谱(HPLC)法对内生真菌的代谢产物进行分析,最终筛选出1株能够产银杏内酯的内生真菌,利用标准曲线法测定其发酵液和菌丝体中总内酯产量约为11.4mg/L。形态学特征和真菌rDNA间隔序列(internal transcribed spacer,ITS)的系统进化分析结果表明,该菌株属于毛霉属,为产银杏内酯内生真菌的首次报道。     

石刁柏内生真菌的多样性研究

为探索百合科天门冬属石刁柏内生真菌的多样性及组织分布特点,为进一步深入研究内生真菌与宿主活性成分互作机制奠定基础。研究采用组织块分离法,对石刁柏不同部位的内生真菌进行了分离鉴定。通过分离率、分离频率、多样性指数和丰富度指数等分析石刁柏内生真菌的分布特点和多样性。共分离得到内生真菌88株,经形态和分子生物学鉴定归属为5纲8目10科13属,其中,镰孢菌属和青霉菌属为根和茎部优势菌群,分别占总菌株数量的37.50%和31.82%;不同组织的石刁柏中,根部位的Shannon-Wiener多样性指数(H')和Margalef丰富度指数(R)最高,分别为1.45和2.03,均匀度(E)最低为0.59。叶与茎的相似性系数稍高,达到0.55。表明石刁柏不同部位中内生真菌分布及组成存在较大差异,且具有一定的组织的专一性。     

一株丹参种子内生真菌ZJZD-3的分离鉴定及其生物活性

目的:从丹参种子中分离纯化内生菌,筛选具有抑菌、抗氧化、抗凝血活性的菌株进行分子鉴定。方法:采用平板分离法从丹参种子中分离内生菌;采用平板对峙法和滤纸片法筛选具有抑菌效果的内生菌,采用DPPH法测定内生菌抗氧化活性,兔耳缘静脉取血测定内生菌抗凝血活性。结果:从白花丹参种子中分离出11株内生真菌和2株内生细菌,从紫花丹参种子中分离出9株内生真菌和9株内生细菌。其中,一株内生真菌ZJZD-3发酵液对丹参病原菌4和6均有抑制作用,抑制率分别为70.1%和59.6%;内生真菌ZJZD-3具有很好的抗氧化能力,其0.5 mg/mL乙醇粗提液对DPPH清除率为91.44%;内生真菌ZJZD-3对于内源性、外源性凝血途径都具有一定的延长作用,并且内源性凝血途径最为明显,对家兔凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活性部分凝血酶时间(APTT)的延长率分别为48.48%、12.38%和34.44%。该菌株经鉴定为篮状菌属(Talaromyces sp.)。结论:内生真菌ZJZD-3具有很好的抗丹参病原菌、抗氧化和抗凝血能力,为丹参药效成分的工业化开发以及丹参的绿色规模化栽培提供新的途径和方法。     

丹参内生真菌产生淀粉酶菌株的筛选鉴定及酶学性质分析

目的:从丹参内生真菌中筛选耐热性强的酸性生淀粉酶菌株,并对其酶学性质进行初步研究。方法:以50株丹参内生真菌作为筛选对象,通过淀粉固体培养基初筛、液体发酵复筛,筛选产生淀粉酶活力较高的菌株;通过形态学观察和ITS序列分析对产酶菌株进行鉴定。结果:从50株丹参内生真菌中,筛选出5株产生淀粉酶活力较高的菌株,其中菌株ZDH2-2-1-1为产淀粉酶活性最强的菌株,酶活力达到117.63 U/m L,经鉴定为互隔链格孢(Alternaria alternata)。该淀粉酶最适p H为4.0,最适反应温度为55℃,具有较好的热稳定性和p H稳定性,对生淀粉具有广谱的降解能力。通过薄层层析发现,ZDH2-2-1-1所产淀粉酶的酶解产物为葡萄糖。结论:丹参内生真菌能产生高活性的耐热性酸性生淀粉酶,在生淀粉深加工中具有极大的开发潜力。     

两种海藻内生菌的分离及其抗氧化活性研究

为研究不同海藻不同内生菌(细菌、真菌)的抗氧化活性差异,并筛选出抗氧化活性较好的菌株。选取广西北部湾海域绿藻门石莼(Ulva lactuca L.)与褐藻门裙带菜(Undaria pinnatifida Suringar)为研究对象,以其清除DPPH、羟基自由基与超氧阴离子的能力综合评价体外抗氧化活性,在抗氧化能力都较强的前12株菌株中进一步遴选出石莼与裙带菜内生细菌与内生真菌各3株进行深入检测。石莼与裙带菜的内生细菌、真菌对DPPH、羟基自由基与超氧阴离子的清除活性均随质量浓度增加而升高;不同藻类的石莼与裙带菜的内生菌抗氧化活性之间存在显著差异(P0.05);同种藻类内生菌间,除裙带菜内生真菌外,整体表现为,石莼与裙带菜的内生细菌对DPPH、羟基自由基与超氧阴离子的半抑制浓度IC_(50)值均显著高于内生真菌,说明石莼与裙带菜内生细菌的抗氧化活性显著低于内生真菌。其中,石莼内生真菌SZ-5菌株清除DPPH、羟基自由基与超氧阴离子的综合能力相对最强,IC_(50)依次为(0.59±0.06)、(1.30±0.36)、(1.14±0.35)mg/mL;经分子鉴定为短梗霉菌属真菌Aureobasidium spp.。     

18株植物内生真菌的分离纯化及鉴定

植物内生真菌生活环境特殊、种类多,通过大量的分离和筛选得到有价值的内生真菌,可以为新型天然产物的获得提供更丰富的来源。本实验随机采摘了12种植物,采用组织分离法从中有选择性地分离纯化得到了18株内生真菌,通过28S r DNA序列测定和系统发育树分析,对18株真菌进行了鉴定。结果表明,这18株内生真菌主要属于Cladosporium,Paramicrothyrium,Mycosphaerella,Colletotrichum,Corynespora,Sarocladium,Guignardia,Phoma,Pseudocercospora,Collembolispora,Alternaria,Glomerella等属,说明了植物内生真菌的丰富多样性。得到的18株内生真菌中有3株不常见真菌和一株新真菌,其次级代谢产物值得进一步研究。     

麻花秦艽不同组织部位可培养内生菌群结构及其与龙胆苦苷含量的相关性

为了明确四川麻花秦艽(Gentiana straminea Maxim)内生菌的资源状况,本实验采用稀释涂布法并结合形态学观察及16S rDNA和ITS-rDNA序列分析的方法,对其根、茎、叶和花中的内生菌进行了分离、纯化和鉴定;并采用高效液相色谱法(HPLC)检测了不同组织部位龙胆苦苷的含量,分析了麻花秦艽可培养内生菌数量与龙胆苦苷含量的相关性。结果表明,麻花秦艽不同组织部位可培养内生菌数量和菌群结构存在一定的差异。其中,从根中得到的可培养内生细菌和真菌的数量均最高,分别为(8.77±0.71)×10~5cfu/g和(2.00±1.05)×10~4cfu/g。统计分析显示,麻花秦艽内生细菌和内生真菌的数量分别与其龙胆苦苷的含量成极显著正相关(P0.01)。从麻花秦艽中共分离得到13株内生菌,归属为3门6纲8目9科10属,其中细菌10株,真菌3株。其中的优势菌株,包括细菌QJ2(Duganella sp.)、QJ6(Rahnella sp.)、QJ10(Pseudomonas sp.)及真菌QJ11(Aspergillus sp.)和QJ13(Aspergillus sp.),其数量均分别与龙胆苦苷的含量成极显著正相关(P0.01)。麻花秦艽内生菌具有较丰富的遗传多样性,不同组织部位麻花秦艽内生菌、种类及分布存在差异,并与其有效成分龙胆苦苷存在极显著正相关性。     

藿香内生真菌次级代谢产物抗菌活性研究

【目的】分离纯化藿香花中内生真菌,测定内生真菌次级代谢产物抑菌活性。方法采用组织分离法从藿香花中分离内生真菌,根据显微形态结构进行初步鉴定;用微量肉汤稀释法测定藿香内生真菌次级代谢产物的最低抑菌浓度(MIC)。结果从藿香茎中共分离得到13株内生真菌,鉴定出12株,分别属于丝核菌属、黑孢霉属、长蠕孢菌属、短蠕孢菌属、丝孢菌属、链格孢菌、镰刀菌属、头孢霉属。大多数藿香内生真菌次级代谢产物的乙酸乙酯部位具有抗菌活性。菌株H-2的乙酸乙酯部位抑菌活性最强,对六种供试菌的MIC均为250μg/mL。菌株H-9的乙酸乙酯部位对无乳链球菌的抑制活性最好,为31.25μg/mL,对其他供试菌在500μg/mL能够表现出抑制活性。结论藿香内生真菌的次级代谢产物具有抑菌活性,为进一步的活性指导分离提供了理论依据。     

药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物的生物活性研究

目的：从植物内生真菌中筛选对单胺氧化酶及乙酰胆碱酯酶具有抑制活性的菌株。方法：用组织切块法分离10种植物中的内生真菌;分离出的内生真菌纯菌株用PDB培养基进行发酵培养,发酵液用等体积乙酸乙酯萃取,菌丝体用3倍量甲醇回流提取两次;用酶标法测定菌液及菌丝体粗提取物的单胺氧化酶及乙酰胆碱酯酶抑制活性。结果：共分离出73株内生真菌并得到146个提取物,其中6株内生真菌粗提取物有强的单胺氧化酶抑制活性,其中JK-1菌液及菌丝体提取物的抗单胺氧化酶活性最强,其IC50分别为3．13μg／mL,7．7μg／mL;1株内生真菌粗提取物有弱的乙酰胆碱酯酶抑制活性。结论：从内生真菌中能筛选出具有强单胺氧化酶抑制活性的次生代谢物。     

蓝莓内生真菌分离纯化及其生物抗性初步研究

从贵州麻江蓝莓种植基地的"粉蓝"蓝莓的健康组织(茎、叶、果实)中分离出41株内生真菌,经分类鉴定为8个菌属,优势属为钉孢属(Passalora sp.);与5株病害菌进行对峙试验发现,内生真菌BB01、BL22、BF27、BF40及BF41可抑制全部5种病害菌生长;使用上述内生真菌次级代谢产物粗提取物进行菌丝生长试验,BB01、BL22、BF27、BF40及BF41次级代谢产物粗提取物含药平板浓度为500μg/mL时对病害真菌生长抑制率均超过90%,表现出显著的抗病害真菌活性;采用PCR扩增内生真菌rDNA-ITS序列构建系统发育树,BF41鉴定为刺盘孢属Colletotrichum sp.,BF40鉴定为苍白尾孢属Pallidocercospora sp.,BL22、BF27、BB01鉴定为枝孢菌属Cladosporium sp.。     

牡蛎共附生可培养微生物多样性的研究

研究牡蛎共附生真菌和细菌的种群多样性。通过牡蛎内生菌群分离、形态学观察、生理生化鉴定及16S r DNA/18S r DNA序列分析等试验,分析牡蛎共生菌的优势种群,并对分离菌的发酵粗产物进行初步成分分析。结果分离获得32株内生细菌,全部属于γ-变形菌纲,其中微球菌和芽孢杆菌为牡蛎内生细菌的优势菌属;分离获得20株内生真菌,分别属于子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和无性型真菌类(Anamorphic Fungi)中的10个属,其中青霉属和曲霉属为牡蛎内生真菌的优势菌属,占分离总数的40%。发酵液粗产物的薄层层析结果表明牡蛎内生菌的发酵产物成分丰富。研究结果表明牡蛎共附生真菌和细菌具有丰富的种群多样性。     

金莲花内生真菌的分离与初步鉴定

从内蒙古采集新鲜的金莲花植株,在确定了该植株内生菌分离的最佳表面消毒方法后,对其根部、茎部和叶部的内生真菌进行分离。通过分析菌落表面形态,从中分离得到6株内生真菌,其中叶中4株,茎中1株,根中1株,并用乳酸酚棉兰液染色镜检观察,经形态学鉴定均为子囊菌亚门(Ascomycotina),青霉属(Pinicielium)。     

6种药用植物内生菌提取物的抗氧化活性研究

本论文以6种具有抗氧化活性的药用植物乌头、唐松草、独活、车前草、薄荷、泽泻为材料分离内生菌,并对内生菌发酵液和菌丝体提取物中抗氧化活性成分进行了研究。实验以PDA培养基分离内生真菌,以高氏培养基分离内生放线菌,测定各提取样品的抗氧化活性,比较其总酚含量和总黄酮含量,并结合形态学和分子生物学方法对高活性菌株进行的鉴定。结果分别分离得到43株内生真菌,18株内生放线菌,其中内生真菌显示了较好的抗氧化活性,对·OH自由基有较强清除(清除率≥70%)作用的菌株有6株,占所用菌株的9.84%。其中菌株DHL-10发酵液乙酸乙酯提取物显示了较强的抗氧化活性,对过氧化氢的IC50为0.26 mg/m L,总酚和总黄酮含量分别达到了0.81±0.05 mg/g和0.84±0.05 mg/g;分子生物学鉴定结合形态学鉴定该菌株为链格孢菌属(Alternaria sp)真菌。本研究的结果证明,药用植物内生菌是抗氧化活性物质寻找的良好资源。     

薰衣草产酚酸内生真菌的分离及产物初步鉴定

利用人工种植的薰衣草及无锡本地采集的相同品种薰衣草,对其各组织内生真菌进行分离、纯化。分别分离得到18和23株内生真菌。对所筛选出的菌株进行固态发酵,并对其发酵培养产物进行提取。通过化学反应的方法从野外采集薰衣草内生真菌中筛选出一株产酚酸的菌株,并通过分子生物学方法对其进行初步鉴定,并对其固态发酵提取物进行初步研究。研究结果表明了薰衣草内生真菌的多样性,为通过微生物固态发酵产酚酸类物质提供理论和实验基础。     

抗皮革霉变的黄芪内生真菌的筛选和鉴定

从黄芪内生真菌中筛选出防皮革霉变菌的拮抗菌。将从自然霉变的皮革制品中分离、纯化到的4株致皮革霉变的真菌作为指示菌,用对峙法从药用植物黄芪根中分离出的20株内生真菌对其进行拮抗活性测定。结果显示:从黄芪根部内生真菌中筛选出了2株对致皮革霉变的真菌有强拮抗作用的内生真菌,经鉴定AR07为刀孢蜡蚧菌,AR15为灰黄青霉。     

西沙野生诺尼种子内生真菌的群落多样性

采用种子表面灭菌、菌种分离与纯化、ITS rDNA和26S rDNA D1/D2区序列测定和系统发育分析方法,对西沙野生诺尼种子内生真菌群落多样性进行了初步研究。从诺尼种子中共分离到内生真菌48株,其中酵母菌39株,霉菌9株;39株酵母菌分属于4个属内的5个种,其中榛针孢酵母(Eremothecium coryli)、Pseudozyma aphidis和浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)为优势种,分别占总菌株数的31.25%、27.08%和16.67%;9株霉菌分属于4个属内的4个种,其中Phaeoacremonium sp.和赤霉属(Gibberella sp.)是霉菌中相对优势的种,分别占总菌株数的8.33%和6.25%。研究结果表明,西沙野生诺尼种子中存在大量内生真菌,且种类丰富,其中酵母菌占绝对优势,部分优势种具有潜在的药用价值。     

酿酒葡萄中内生霉菌的分离与初步鉴定

采用组织块培养法,对新疆优质酿酒葡萄“赤霞珠”中的内生霉菌进行分离、纯化,共得到24株不同的内生霉菌,其中秋天得到的菌数最多,为11株,春天次之,为8株,夏天最少,为5株;从酿酒葡萄的根、茎、叶、果实部位均分离得到了内生真菌,分别为7、5、9和3株.通过对其中两株产多酚能力较强的内生霉菌C-2-J-6和C-1-G-3的形态鉴定,初步确定这两株菌分别属于星珠毒属和青霉属.     

药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物生物活性研究

目的 从7种植物的内生真菌中筛选对单胺氧化酶和乙酰胆碱酯酶具有抑制活性的提取物。方法用组织块法分离7种植物中的内生真菌;对分离出的纯内生菌用液体培养基发酵培养,用等体积乙酸乙酯萃取发酵液并用甲醇对菌丝体进行索氏提取,得到各组分提取物;酶标法测定提取物的单胺氧化酶抑制、乙酰胆碱酯酶抑制活性。结果共分离出96株内生真菌,有5种内生真菌萃取物有不同程度的抑制单胺氧化酶活性,其中以DLC-4-L组份的抑酶活性最强,其IC50为29．2ug／mL。结沦药用植物中存在丰富的内生真菌,其代谢产物具有一定的抗单胺氧化酶活性,可作为筛选单胺氧化酶抑制剂的新资源。     

GM稻米镰刀菌毒素安全性评估及内生真菌类群成因分析

本文旨在评估货架期转基因 (Genetically Modified,GM) 稻米镰刀菌毒素含量的安全性和内生真菌类群的多样性变异特征,探究内生镰刀菌产毒的可能成因。收集转基因水稻株系及各自的对照亲本品种,利用ELISA法检测稻米及其内生镰刀菌株毒素含量;采用ITS高通量测序技术检测稻米内生真菌群落。结果：(1) 4个稻米样本中均检出了低剂量镰刀菌毒素,其中ZEN、DON和T-2三种毒素的含量在0.4 μg/kg~25.8 μg/kg之间,且GM稻米与亲本间均无显著差异（P>0.05）;仅在GM稻米样本FT16中检出了含量为10.0 μg/kg的FB1。(2) 16株内生镰刀菌株均能产生ZEN,其中9株还能合成T-2毒素。(3) 4个稻米样本共检出9个内生真菌门和68个真菌属,其中优势真菌均为子囊菌门,镰刀菌属(Fusarium) 和弯孢菌属(Curvularia)。两个GM稻米样本内生真菌α多样性指数均与其亲本无显著差异（P>0.05）。GM稻米属水平的内生真菌标志物种均比其相应亲本显著减少。结论：货架期内的稻米样本检出的镰刀菌毒素含量远低于国家标准,不构成食品安全风险。GM稻米内生真菌类群多样性指数与其亲本实质等同,标志菌属变异处于安全范围内。低剂量镰刀毒素普遍存在和内生镰刀真菌产毒风险值得警惕。