苏云金芽孢杆菌cry1Aa核心毒素基因转化烟草及其杀虫活性

将苏云金芽孢杆菌cry1Aa的C端编码区截短,获得编码N端609个氨基酸约1.8kb的核心毒素基因,将其构建到植物表达载体转化烟草,研究直接表达的活性ICP核心毒素被昆虫取食后的杀虫效果.T1代种子发芽的抗生素抗性分离和PCR检测证实cry1Aa核心毒素基因整合到了烟草基因组,Western 杂交检测表明转化烟草能够正常表达大小为75.6kD的核心毒素蛋白.生物测定结果表明,转化烟草对初孵棉铃虫平均有高于60%的致死率,对初孵甜菜夜蛾平均达到70%的致死率,最高致死率均可达到90%以上,并对昆虫的生长发育有明显的抑制作用.     

苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因vip3A的研究

根据已知vip3A基因序列设计一对特异性引物VIP3／VIP5,对218株Bt菌株进行PCR鉴定,有51株含有vip3A类基因,其中12株为不同亚种的标准菌株,有4株标准菌株不含有该基因。从Bt C9菌株中分离克隆了vip—C9基因,并插入表达载体pET—21b,转化大肠杆菌BL21,诱导表达出分子量88．6kDa的可溶性蛋白,表达产物对甜菜夜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性,LC50分别为0．42ng／mg和25．95ng／mg,对小菜蛾活性较低。构建了缺失蛋白Vip—C9—N(N端去除39个氨基酸组成的信号肽序列),杀虫活性测定结果表明其对甜菜夜蛾的活性显著降低,说明N端39个氨基酸对甜菜夜蛾的活性是必需的。     

苏云金芽孢杆菌cry1Aα核心毒素基因转化烟草及其杀虫活性

将苏云金芽孢杆菌cry1Aα的C端编码区截短，获得编码N端609个氨基酸约1.8kb的核心毒素基因，将其构建到植物表达载体转化烟草，研究直接表达的活性ICP核心毒素被昆虫取食后的杀虫效果。T1代种子发芽的抗生素抗性分离和PCR检测证实cry1Aα核心毒素基因整合到了烟草基因组，Western杂交检测表明转化烟草能够正常表达大小为75．6kD的核心毒素蛋白。生物测定结果表明，转化烟草对初孵棉铃虫平均有高于60％的致死率，对初孵甜菜夜蛾平均达到70％的致死率，最高致死率均可达到90％以上，并对昆虫的生长发育有明显的抑制作用。     

两段杨树叶绿体DNA片段的克隆及叶绿体定点转化载体的构建

利用PCR方法,从毛白杨（Populus tomentosa C.）叶绿体基因组中克隆了1．7kb和1．6kb的相邻DNA片段,对其进行序列分析表明,扩增片段分别具有1766个和1601个核苷酸,前者包括3′rps12,rps7基因的编码区及其边界序列,后者包含ndhB基因的第一外显子和内含子。本文还构建了杨树这两个片段的限制酶切图谱,并以这两个相邻片段为同源重组片段,分别将绿色荧光蛋白（GFP）基因和苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白（Bt）基因,及其原核表达框插入其间,构建了杨树叶绿体定点转化载体pPZG和pPZB。这两个特异性载体将定位整合到杨树叶绿体基因组中反向重复区的rps7和ndhB基因的间隔区,并高效表达GFP和Bt基因。迄今为止,本文所报道的内容在国内、外尚属首次。     

利用血红蛋白基因提高短小芽孢杆菌在低氧条件下的碱性蛋白酶产量

将透明颤菌血红蛋白基因vgb成熟肽编码区序列分别与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P43双启动子和短小芽孢杆菌(B. pumilus)碱性蛋白酶基因启动子wBp连接,利用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pSUGV4分别构建组成型表达质粒pSUP43Vgb和pSUwBpVgb,将其分别转化短小芽孢杆菌UN-31-C-11.SDS-PAGE和CO差异光谱检测表明,融合基因在UN-31-C-11中均得到了表达,并且表达质粒使重组菌株在低氧条件下的生长量在对数生长后期超过对照菌株20%以上,同时促进了短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达,其产量高于对照30%以上.     

牛α(1,3)-半乳糖转移酶基因片段的克隆及一种全新的无启动子打靶载体的构建

利用La—PCR的方法，从牛的基因组中成功地获得分别约为2．4kb、15．0kb的两段扩增产物。两个片段分别克隆于pCR—XL—TOPO载体。测序结果表明所克隆的两片段均为牛α(1，3)GT基因的基因组序列。其中2．4kb片段位于5～7外显子之间，包括了完整的第五及第六内含子；15．0kb片段位于3～4外显子，包括了完整的第三内含子。15．0kb、2．4kb片段分别作为打靶载体的5’、3’同源臂，使用融合基因策略构建了一种全新的无启动子打靶载体7zf-neo17．4。电击转染牛胎儿成纤维细胞以期敲除牛的α(1，3)-GT基因。     

斜带石斑鱼sox3基因cDNA的克隆及其时空表达特征分析

采用RACE-PCR方法从斜带石斑鱼的下丘脑SMART cDNA中克隆sox3基因，并研究其时空表达模式。研究结果表明，sox3 cDNA片段全长1152bp，共编码300个氨基酸。该基因在未受精卵和桑椹胚期仅可检测到微弱的转录本，从高囊胚期开始转录，一直到鱼苗1天，都维持着较高的表达水平。在肝和肾等6种组织中均检测不到转录本的存在，而在包括垂体和下丘脑等6种脑组织中可检测到不同强弱的转录本，呈现出很强的中枢神经系统的表达特异性。在未成熟卵巢中可检测到大量转录本的存在，在成熟卵子中可检测到微弱的转录本，而在处于变性期的性腺中检测不到转录本的存在，呈现出很强的雌性性腺特异性。由此我们推断，sox3基因在石斑鱼的中枢神经系统发育和卵子发生过程中起了重要作用。     

栉孔扇贝C型凝集素基因的克隆与表达研究

C型凝集素作为凝集素家族中的主要成员之一,在识别外来微生物表面碳水化合物基团和激活体液中免疫因子等方面具有重要作用。本研究在EST分析的基础上采用锚定PCR方法克隆得到了该基因的全长cDNA。克隆得到的栉孔扇贝C型凝集素cDNA全长1038bp,编码区684bp,可以编码228个氨基酸。在该编码的氨基酸序列中发现了C型凝集素家族的特征模体和一个C型凝集素的结构域(C-type leetin domain,CTLD)。通过Clustalw和SMART分析在该序列中发现了形成二硫键的4个保守的半胱氨酸,与其他物种C型凝集素的二硫键结构非常相似。结合BLAST分析的结果,可以确认所获得的cDNA序列是栉孔扇贝C型凝集素的编码序列。用RT-PCR技术在鳗弧菌感染前后的血细胞中均可以检测到该基因的表达,但病原刺激前的表达水平相对较低,病原刺激后4h起表达开始升高,并在6h达到最高,随后逐渐开始下降,并于32h恢复到原来水平,该结果表明C型凝集素存在组成型和诱导型两种调控机制,在扇贝防御病原感染的过程中发挥重要作用。     

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。     

Expression of P-glycoprotein and CYP3A4 along the porcine oral-gastrointestinal tract: implications on oral mucosal drug delivery

Objectives: To characterize the expression of Pgp and CYP3A4 along the oral-gastrointestinal (GI) tract for understanding the potential roles of CY3A4 and Pgp in oral mucosal drug delivery.

Design: Porcine buccal mucosa, sublingual mucosa, esophagus and jejunum, ileum and colon tissues were used for studying the mRNA and protein expression of CYP3A4 and Pgp. mRNA and protein were determined using real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) and western blot, respectively. The expression levels of CYP3A4 and Pgp in different segments of oral-GI tract were compared.

Results: Levels of Pgp mRNA were significantly lower (14–40 times lower) in buccal and sublingual mucosa than that in intestine. In contrast, higher levels of CYP3A4 mRNA were observed in the oral mucosa as compared to that in intestine, but the difference was not statistically different. The levels of Pgp protein along the oral-GI tract followed the order: sublingual ～buccal ～esophagus < jejunum ～ileum ～ colon while the expression of CYP3A4 protein in the oral mucosa was similar to that in intestine.

Conclusion: Expression of Pgp in oral mucosa is lower than that in intestine, while the expression of CYP3A4 in oral mucosa is similar to that in intestine. Because of lower Pgp in oral mucosa, oral mucosal drug delivery can be used as an alternative strategy to avoid the coordination of Pgp and CYP3A4 metabolism in drug absorption. However, CYP3A4-dependent metabolism may play a role in oral mucosal drug delivery as in per oral-GI absorption.     

洋葱假单胞菌G63脂肪酶基因及其伴侣基因的克隆和同源高效表达

从油污土壤中筛选到一株脂肪酶活性较高的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)G63.运用PCR的方法从该菌株中克隆了脂肪酶基因(lipA)及其伴侣基因(lipB).该脂肪酶基因开放式阅读框(ORF)为1092bp,编码364个氨基酸残基.经KpnⅠ/HindⅢ酶切,将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上,构建成质粒pBBR1-lipAB.通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,转入原宿主菌P.cepacia G63中,构建成lipA基因同源高效表达的基因工程菌.该菌株在连续转接5次,培养45h后质粒保持率为82.6%,适用于规模化发酵生产.摇床发酵表明,工程菌在60h时酶活达到150.63 U/mL,较原始菌株提高3.6倍.     

不同浓度Mg-6Zn合金浸提液对肠上皮细胞凋亡及其相关基因Caspase-3表达的影响

研究不同浓度Mg-6Zn合金浸提液对大鼠肠上皮细胞IEC-6的凋亡及凋亡相关基因Caspase-3表达的影响。将Mg-6Zn合金制成不同浓度(20%和40%)的浸提液体外培养大鼠肠上皮细胞IEC-6,并以含10%胎牛血清的高糖DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)培养基作为阴性对照。采用噻唑蓝(MTT)法通过计算细胞相对增殖率检测不同浓度合金浸提液对IEC-6细胞的毒性作用;采用流式细胞仪检测不同浓度合金浸提液对IEC-6细胞凋亡的影响;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测不同浓度合金浸提液对IEC-6细胞凋亡相关基因Caspase-3mRNA表达的影响。实验结果表明,20%和40%两种浓度的镁合金浸提液在体外培养IEC-6细胞第七天时细胞毒性分级分别为0级和1级,属于无毒性,符合医用材料细胞毒性分级的合格标准。40%和20%浓度镁合金浸提液中,IEC-6细胞的凋亡比例及Caspase-3活化度相对于对照组都增高,差异有统计学意义(P0.05),40%浓度组中,IEC-6细胞的凋亡比例及Caspase-3活化度相对于20%浓度组增高,差异有统计学意义(P0.05),说明Mg-6Zn合金浸提液在一定范围内处于较高浓度时易诱导IEC-6细胞的凋亡及Caspase-3的表达,且随浓度升高影响越大。     

电磁轨道炮导轨失效研究现状及展望

电磁轨道炮是一种具有重大应用价值的新概念武器,在介绍电磁轨道炮导轨失效研究的发展历史及现状的基础上,主要对导轨失效形式、特征、原因以及抑制失效的方法进行了总结,并展望了未来电磁轨道炮导轨失效研究的发展趋势.