柯萨奇B组1型病毒株MSH-KM9-09的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackievirus B1,CVB1)分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试验,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对分离株进行鉴定,RT-PCR法扩增病毒全长VP1基因,进行序列测定,并采用Mega 4.1等软件进行分析。结果所分离的毒株经微量中和试验定型为CVB1亚型,编号为MSH-KM9-09。经RT-PCR扩增获得834 bp的VP1基因,与国内CVB1分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在86.1%和97.8%以上,与国外CVB1分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.2%～83.2%和94.3%～96.0%;在系统进化树上,MSH-KM9-09株与国内分离株属于同一个分支,而国外分离株分属其他两个不同的分支。结论 MSH-KM9-09分离株为肠道病毒CVB1。     

2015年山东省烟台地区柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析

目的研究2015年山东省烟台地区手足口病(hand,foot,and mouth disease,HFMD)的病原谱,并分析病原谱中柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)流行株的进化及VP1区重要氨基酸位点的变异情况。方法采用实时荧光逆转录聚合酶链反应方法,对2015年烟台地区采集于HFMD患者的696份样品进行肠道病毒(enterovirus,EV)核酸检测和分子定型。根据EV的优势血清型,选取10株CV-A16扩增VP1区,并进行核苷酸序列及系统发育分析。结果从696份标本中检出EV 412株,其中101株为CV-A16,76株为EV-A71型。10株CV-A16的核苷酸序列相似性为88.4%~99.9%,氨基酸序列相似性为98.6%~100%。10株CV-A16烟台株分别属于B基因型的B1a和B1b进化分支,其中B1b进化分支为优势株。与参考株Tainan/5079/98(AF177911)相比,10株CVA16分离株氨基酸序列的第11、23、99、145、289位氨基酸出现突变,10株分离株的这些位点也有不同,表明烟台地区的CV-A16有其独特的突变位点。结论 CV-A16是引起2015年烟台地区HFMD发病的常见病原体,本次分离到的CV-A16均属于B基因型的Bla和B1b进化分支。     

一株柯萨奇病毒A9分离株的VP1基因遗传特征分析

目的分析引起病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)的一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)A9分离株(CVA9)的VP1基因遗传特征。方法采用KMB17细胞对VE患儿粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1全基因,并测序,采用Mega 6.1和Geneious 5.6.5等软件分析其序列,并构建系统进化树。结果从5份VE患儿粪便中分离到一株人CVA9,命名为A108/YN/CHN/2009,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVA9一致,均为906 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4%~98.2%和96.4%~99.3%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~96.0%和92.7%~99.0%。在进化树上与其他中国分离株属同一分支中不同两个亚分支,与JB141230009亲缘关系较近。结论 A108/YN/CHN/2009分离株为肠道病毒CVA9血清型,与其他中国分离株同属一个基因簇。     

柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)VP1蛋白,并检测其免疫原性。方法通过RT-PCR法从CA16病毒青岛株中扩增VP1基因,克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中,构建重组表达质粒pET43.1a-VP1,转化感受态E.coli Rossatte(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组CA16 VP1蛋白通过Ni柱亲和层析纯化后,采用不同剂量(5、10、20、40μg)免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价,微量细胞病变抑制法检测血清中和抗体效价。结果重组表达质粒pET43.1a-VP1经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组CA16 VP1蛋白相对分子质量约为34 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%;纯化的重组CA16 VP1蛋白纯度可达95%以上,可与猴CA16抗血清反应;不同剂量的重组CA16 VP1蛋白免疫BALB/c小鼠,可诱导产生CA16特异性抗体,血清中总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体效价均明显高于对照组,且抗体效价与免疫剂量存在一定的量效关系;各剂量CA16 VP1组免疫小鼠血清中和抗体效价均小于1∶8。结论已成功在大肠杆菌中表达了重组CA16 VP1蛋白,纯化的重组蛋白可诱导小鼠特异性体液免疫应答,为进一步研究CA16的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。     

33株柯萨奇病毒A组16型分离株的全基因序列分析

目的对2008～2010年北京和青岛地区流行的33株柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)分离株的全基因序列进行分析。方法收集2008～2010年北京和青岛地区CA16感染患者咽拭子标本,采用Vero细胞对病毒进行分离,并经噬斑纯化。提取病毒RNA,采用RT-PCR法分段扩增CA16全长基因,经序列测定和拼接后,利用DNAStar和MEGA5.10软件分析全基因序列。结果经病毒分离和噬斑纯化,共获得33株CA16分离株;33个分离株之间的核苷酸序列同源性大于90.9%,与CA16国际标准株G10各区段的核苷酸序列同源性为72.7%～89.0%,氨基酸序列同源性为79.3%～100.0%;与近年中国分离的CA16 SZ/HK08-7株同源性较高,全基因组同源性大于91.5%,各区段核苷酸序列同源性均大于83.7%;在基于VP1序列的种系进化树中,BJWG16、BJWG17、BJWG20等23个分离株属于C1亚型,其余10个分离株属于C3亚型。结论 2008～2010年北京和青岛地区流行的33株CA16分离株均为C基因型。本研究对我国CA16分子流行病学、毒力位点的研究以及疫苗株的选择具有重要意义。     

柯萨奇病毒A组16型临床分离株的生物学特性分析

目的对引起手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的重要病原体柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus group A type16,CA16)临床分离株的生物学特性进行分析,为后续的疫苗研发奠定基础。方法从昆明地区HFMD临床疑似患者178份咽拭子及粪便标本中分离并鉴定CA16毒株,并对病毒的生长特性、蚀斑形态以及对乳鼠的致病性等生物学特性进行分析。结果共分离出7株CA16病毒:KM1、KM15、KM154、KM165、KM168、KM263、KM881,均属于B1亚型;病毒在Vero细胞上增殖较快,多数毒株4~6 d即可达到增殖高峰,但感染性滴度差别较大,最低为4.75 lgCCID50/ml,而最高可达7.78 lgCCID50/ml;各毒株在Vero细胞上培养相同时间形成的蚀斑形态不同,其中KM15、KM154、KM168蚀斑呈圆形,针尖样大小,边缘较清晰,KM1、KM881、KM263、KM165蚀斑较大,不规则,边缘较模糊;各毒株毒力均较强,经乳鼠颅内注射后,乳鼠均于3~6 d陆续开始发病,除KM168、KM154、KM15组乳鼠为不同程度的发病及死亡外,其他组乳鼠发病率及病毒致死性死亡率均达100%;各毒株对乳鼠的脑、心肌、肺、肌肉、脊髓和肝脏等组织均有不同程度的损伤,其中损伤较严重的组织为脑和肌肉。结论分离的CA16毒株对Vero细胞均具有良好的适应性,蚀斑清晰,毒力较强,且多数毒株感染性滴度较高,可用于CA16病毒致病机理的研究及疫苗的研发。     

柯萨奇病毒A组16型cDNA感染性克隆的构建

目的构建柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)c DNA感染性克隆。方法提取CA16基因组RNA,经RT-PCR得到基因组全长c DNA,插入至TOPO-XL-PCR载体,获得CA16全长c DNA克隆。采用T7聚合酶系统将线性基因组c DNA体外转录出病毒基因组RNA,纯化后转染Vero细胞,获得拯救病毒。通过RT-PCR、基因测序及免疫荧光法对拯救病毒进行鉴定,并对拯救病毒与母本病毒的增殖特性进行比较。结果病毒基因组RNA转染Vero细胞后48 h,可见典型的肠道病毒致细胞病变。拯救病毒经RT-PCR、基因测序和免疫荧光鉴定为CA16,且与母本野生型病毒增殖特性基本一致。结论成功构建了具有感染性的CA16全长c DNA克隆,为研究CA16基因功能和研发CA16新型疫苗奠定了基础。     

一株柯萨奇病毒B2分离株的VP1基因序列特征分析

目的分析一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)B2分离株(CVB2)全VP1基因序列特征。方法用RD细胞对10份HFMD疑似患儿的粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1基因,并测序,采用NCBI BLAST、Mega 6.1和Geneious等软件进行序列分析,并构建系统进化树。结果从10份HFMD疑似患儿粪便中分离到一株CVB2,命名为509/YN/CHN/2010,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVB2一致,均为846 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~95.3%和97.9%~98.9%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.1%~87.8%和97.9%~98.6%。在进化树上与其他中国分离株分属不同的两个分支,而与M10MG17亲缘关系较近。结论 509/YN/CHN/2010分离株为肠道病毒CVB2,为两个中国分支中的一支。     

一株鼻病毒A22型的分离鉴定及其VP1基因遗传特征分析

目的分析2011年昆明市手足口病患儿粪便中分离获得的人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)A22型分离株KM4/2011全长VP1基因的遗传特征。方法采用KMB17细胞对手足口病患儿粪便样本中筛查出的1株HRV样品进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增病毒VP1基因,并进行测序,采用BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对;采用Geneious basic 5.6.5软件进行核苷酸和氨基酸同源性比对;采用Mega 5.05软件将HRV A22及部分HRV A、B和C群全长VP1基因构建系统进化树。结果分离株为KM4/2011,经扩增、测序和序列拼接获得长度为867 bp的VP1基因;KM4/2011株与其他HRV分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为48.1%~91.0%和38.2%~97.6%,其中与HRV A22分离株的核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为90.8%~91.0%和97.3%~97.6%;基因进化树分析显示,KM4/2011株与HRV A22基因型属于同一个进化分枝。结论 KM4/2011分离株为HRV A22型,存在地域差异。     

柯萨奇病毒A组16型疫苗的研发进展

柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)是引起手足口病(hand,foot and mouth desease,HFMD)的主要病原体之一。研发CA16疫苗对控制HFMD流行具有重要意义。本文探讨了CA16疫苗研发的必要性和可行性,并对CA16疫苗中和抗体检测方法、动物模型、重组病毒样颗粒(recombinant virus-like particles,rVLPs)疫苗及灭活疫苗等相关的研发进展作一综述。     

柯萨奇病毒A组16型病毒样颗粒的制备及其免疫原性

目的应用Bac-to-Bac杆状病毒系统表达柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CVA16)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP),通过条件优化,提高VLP的表达量,纯化后检测其免疫原性。方法对CVA16结构蛋白基因P1及蛋白酶基因3CD进行密码子优化,插入启动子P10改造为CMV的重组杆状病毒表达载体p Fast Bac Dual-CMV中,获得重组穿梭质粒p Fast Bac Dual-CMV-P1-3CD,转化DH10 Bac TM Competent Cells,提取重组杆粒Bacmid-CMVP1-3CD,转染Sf9细胞,组装成重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD,并进行扩增,采用间接免疫荧光法、Western blot法及透射电镜观察对表达产物进行初步鉴定。对重组CVA16 VLP的表达条件(病毒接种MOI值、感染时间及细胞培养方式)进行优化后,通过20%蔗糖垫层及氯化铯连续密度梯度离心法纯化CVA16VLP,并通过腹部皮下注射免疫ICR小鼠3次,采用间接ELISA法检测小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,微量中和试验法检测血清中和抗体滴度。结果重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD经PCR及测序鉴定证实组装成功;重组CVA16 VLP在Sf9细胞中成功表达,优化的表达条件为:重组杆状病毒Ac MNPV-CMV-P1-3CD按MOI=5接种,Sf9细胞采用悬浮培养方式悬浮培养96 h,收集细胞及培养上清;纯化的CVA16 VLP纯度可达90%以上,针对VP2的单克隆抗体能与VP0及VP2发生特异性反应,电镜下可见大量形态规则的类球形VLP,直径约为27 nm;纯化的CVA16 VLP免疫ICR小鼠后,诱导机体产生的特异性血清Ig G滴度可达1∶105,中和抗体滴度达1∶358。结论应用杆状病毒表达系统成功表达了CVA16的P1和3CD蛋白,并组装形成完整的VLP;通过质粒启动子的改造及表达条件的优化,有效提高了CVA16 VLP的表达量;纯化的CVA16 VLP可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,为CVA16亚单位疫苗的研究提供了参考。     

柯萨奇病毒A组16型中和抗体检测方法的实验室评价

目的评价柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)中和抗体检测方法于不同实验室内和实验室间的可重复性。方法参照WHO脊髓灰质炎病毒中和抗体检测方法,建立CA16中和抗体检测方法和实验标准;收集22份血清样品,对CA16 A基因型毒株G10及B基因型毒株W190、33、203、P11和CS02毒株独立进行CA16中和抗体有效检测实验,评价所建立的检测方法于A~G实验室内和实验室间的可重复性;分别于A、B、C、D和E实验室比较G10毒株与W190、33、203、P11和CS02毒株对CA16中和抗体检测结果的影响。结果在各实验室内,有17/22份血清样品的变异系数(variable coefficient,CV)在0~11.4%之间,表明该检测方法在同一实验室内具有较好的可重复性;在实验室间,除3份低效价血清和1份效价过高血清外,其余血清样品的几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)最大差异倍数均在3.0倍以内,实验室间检测差异在可接受范围内;W190、33、203、P11和CS02毒株与G10毒株检测结果趋势相近。在同一实验室内,W190和33毒株与G10毒株的检测结果差异无统计学意义;203、P11和CS02毒株的检测结果均低于G10毒株,差异有统计学意义,表明B基因型毒株与A基因型毒株生物学活性存在一定差异。结论以G10毒株检测CA16中和抗体的方法在各协作实验室可得到良好应用,有利于CA16中和抗体检测的标准化,但适用性需进一步评估和验证。     

云南省1株柯萨奇病毒A组8型分离株全基因组分析

目的 分析柯萨奇病毒A组8型（Coxsackievirus A8,CVA8）云南分离株A8-1/YN/CHN/2019全基因组序列及其遗传特性,以期了解CVA8的流行和变异情况。方法 设计针对CVA8的引物,提取病毒RNA,RT-PCR扩增VP1序列并测序,BioEdit 7.2.3拼接得到全基因组,使用MEGA 7.0软件进行系统进化分析,应用Simplot 3.5.1及RDP4软件进行重组分析。结果 A8-1/YN/CHN/2019株长7 396 nt,编码2 188个氨基酸。其VP1与CVA8原型株AF081299/Donovan/USA/1998核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为81.04%和95.24%;A8-1/YN/CHN/2019株属于基因型E,其他中国分离株位于D和E型。重组分析发现A8-1/YN/CHN/2019株在非结构编码区的P2和P3段上发生重组。结论 A8-1/YN/CHN/2019株为E基因型,并在P2、P3段的非结构区发生了重组事件。     

2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。     

柯萨奇病毒A组16型实壳病毒颗粒与空壳病毒颗粒免疫原性的比较

目的比较柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)实壳病毒颗粒(full particle,FP)和空壳病毒颗粒(empty particle,EP)的免疫原性。方法以CVA16病毒株CVA16-L731感染Vero细胞,采用10层细胞工厂培养工艺培养病毒,收获液经离心纯化后,用甲醛灭活,获得灭活纯化的CVA16-L731 FP和EP。采用BCA法检测CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度,4%~12%SDS-PAGE、Western blot及透射电镜对CVA16-L731 FP和EP进行鉴定。以氢氧化铝为佐剂,分别以EP、FP、EP/FP为抗原,于第0、14、28天经后肢肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,于0、7、21、35、49、63、77、91 d对小鼠进行眼眶采血。采用微量中和试验法检测免疫小鼠血清中和抗体滴度,ELISA法检测免疫小鼠血清特异性Ig G抗体滴度,母传抗体保护试验检测CVA16-L731 FP和EP的垂直保护效果。结果纯化后的CVA16-L731 FP和EP的蛋白浓度分别达到420和150μg/ml;CVA16-L731 FP可见4条相对分子质量分别约为34 000(VP1)、26 000(VP2)、24 000(VP3)和8 000(VP4)的条带,CVA16-L731 EP可见3条相对分子质量分别约为36 000(VP0)、34 000(VP1)和24 000(VP3)的条带;CVA16-L731 FP和EP的纯度均可达95%;CVA16-L731 VP1兔多抗可与FP及EP的VP1、CVA16-L731 VP2兔多抗可与FP-VP2及EP-VP0发生特异性免疫反应;CVA16-L731FP和EP分别为内部不可被磷钨酸负染的FP致密圆形颗粒和内部可被磷钨酸负染的黑色EP圆型颗粒。小鼠免疫试验结果显示,第1次免疫后各抗原免疫组小鼠血清中和抗体阳性率均为100%;第2次免疫后血清中和抗体滴度和血清特异性Ig G水平均显著升高;第3次免疫后血清中和抗体滴度均无明显变化,但血清特异性Ig G水平均明显升高;第3次免疫后的63 d内,血清中和抗体滴度均无显著变化。各抗原免疫组乳鼠存活率均为100%。结论CVA16-L731 FP和EP均能诱导小鼠持续产生较高水平的血清中和抗体和特异性Ig G抗体,且母传抗体可保护2日龄乳鼠抵抗CVA16-S315的致死性攻击,为CVA16疫苗的研制提供了实验依据。     

柯萨奇病毒A16型疫苗的研究进展

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由肠道病毒引起的传染病,柯萨奇病毒A16型(Coxsackie-virus type A 16,CA16)和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引发HFMD流行和暴发的主要病原菌.HFMD在5岁以下的儿童中可引起口腔疼痛...     

柯萨奇病毒A组6型衣壳蛋白VP1的原核表达及其抗血清的制备

目的原核表达柯萨奇病毒A组6型(Coxsackie virus group A 6 strain,CVA6)衣壳蛋白VP1,并制备其抗血清。方法合成经密码子优化的CVA6-VP1全长基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28a-VP1,转化感受态E. coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达目的蛋白,同时优化IPTG终浓度(0. 1、0. 2、0. 3、0. 5 mmol/L)、诱导温度(15、20、25、30℃)及诱导时间(6、8、12、16 h)。表达产物采用Ni-NTA柱亲和层析纯化,将纯化重组蛋白免疫新西兰兔,制备VP1抗血清,微量细胞病变法检测血清抗体效价。结果重组质粒p ET-28a-VP1经双酶切及测序鉴定,构建正确。重组蛋白最适诱导条件为:IPTG终浓度为0. 3 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为12 h。重组蛋白相对分子质量约34 000,于上清和包涵体中均有表达,纯化后纯度可达95%以上。兔血清效价均> 1∶8,呈阳性。结论成功于原核表达系统中高效表达了可溶性CVA6-VP1蛋白,且获得效价较高的抗血清。     

柯萨奇病毒A组16型抗原表位预测

目的应用模拟表位策略研究柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16)抗原表位。方法分别以具有中和活性的抗CA16单克隆抗体2C6、4F9、1D8为靶分子,在噬菌体12肽库中淘选可与之特异性结合的阳性克隆,对淘选得到的阳性克隆进行序列测定和比对,并采用Phage ELISA法进行特异性鉴定。同时利用生物信息学方法对CA16衣壳蛋白理化性质进行分析,并与阳性噬菌体多肽序列和结构进行比对,预测CA16中和抗原表位。结果经噬菌体12肽库筛选,单克隆抗体2C6、4F9、1D8淘选阳性噬菌体富集率分别为2.39×10~3、1.32×10~4和3.762×10,获得可与单克隆抗体2C6、4F9、1D8结合的阳性克隆分别为10、11、6种,其中各组共有基序分别为K+X+WW和N/Q+S/T+Y/F/W、K+X+WW+D/E、T+X+P+W。Phage ELISA特异性鉴定阳性克隆肽CA1和CB1、FB3和FC3、DA1和DA2、DA5分别强特异性结合单克隆抗体2C6、4F9、1D8。经计算机预测分析,确定了主要位于CA16 VP1 800-810区域,并涉及VP4、VP3上的多个中和表位区域。结论应用模拟表位策略成功筛选出了CA16中和抗原表位,为CA16蛋白抗原结构、新型表位疫苗及诊断试剂的进一步研究奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型抗原定量检测ELISA方法的建立及初步应用

目的建立柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A type 16,CA16)抗原定量检测的ELISA方法,用于CA16疫苗中抗原的定量检测。方法以纯化的CA16病毒颗粒作为免疫原,分别免疫家兔和BALB/c小鼠,制备抗CA16多克隆抗体和单克隆抗体。以抗CA16多抗作为包被抗体,经HRP酶标记的单抗作为酶标抗体,建立CA16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,确定该方法的线性范围,并进行准确度、精密度、稳定性及特异性验证。用建立的方法检测CA16疫苗原液制备过程样品中CA16抗原含量。结果以抗CA16多抗为包被抗体,针对74株不同基因型的CA16的ELISA检测结果均为阳性,该抗CA16单抗的广谱性较好。该方法的线性范围为23.4~750 ng/ml,R20.99,最小检出量为23.4 ng/ml;样品回收率在89%~108%之间,CV15%,准确度和精密度较好;抗体包被板干燥后于37℃放置6 d,CV20%,稳定性较好;PV纯化样品、EV71收获液、Vero细胞样品中抗原的A值均小于cutoff值,特异性较好。随着CA16疫苗制备过程的不断进行,中间品1~4比活分别为0.44、0.64、92.13和1 239.03,呈逐渐上升趋势。结论建立了CA16抗原定量检测的双抗体夹心ELISA方法,该方法准确度、精密度高,稳定性及特异性较好,为CA16疫苗的研制及工艺开发奠定了基础。     

柯萨奇病毒A组16型免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析

目的对柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus groups A type 16,CoxA16)4个毒株进行免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析。方法提取CoxA16 G20、KM/M08、MY08和KM208病毒RNA,PCR扩增VP1基因,并进行测序;利用MEGA4.0软件中Bootstrap Test of phylogeny→Neighbor-joining方法对13株CoxA16基于VP1基因全序列构建CoxA16种系进化树并进行基因分型,使用DNAMAN软件对4个毒株VP1核苷酸序列的同源性及其蛋白质氨基酸序列差异位点进行分析。分别用纯化灭活后的4株CoxA16免疫BALB/c小鼠,于初次免疫和二次免疫后的第14、28天采血,分离血清,Western blot法检测G20毒株免疫的小鼠血清中抗体的的特异性;微量中和试验法检测血清中和抗体效价并进行交叉中和试验。结果 G20、MY08和KM208毒株属于B2b基因型,而KM/M08毒株属于B2a基因型;4个毒株间VP1基因核苷酸序列的同源性为91.8%～99.0%;MY08与其他3个毒株相比,在VP1的第102位(N→D)、241位(E→K)和248位(T→A)上存在3个差异氨基酸位点。G20毒株的抗血清可特异识别CoxA16的VP1和VP2蛋白,具有良好的免疫原性;各实验组二次免疫后第28天中和抗体效价均高于其他检测时期,其中MY08组中和抗体效价明显低于其他3组,差异有统计学意义(P﹤0.01);G20、KM/M08、和KM208毒株间的交叉保护能力优于MY08毒株对G20、KM/M08和KM208毒株的交叉保护能力,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 4株CoxA16灭活后均能诱导机体产生相应的中和抗体和交叉保护能力,其中G20、KM/M08和KM208毒株在灭活后,显示了更好的免疫原性和毒株间交叉保护能力。