人呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,hRSV）是婴幼儿和老年人发生严重呼吸道疾病的主要病因之一,据统计全球每年因hRSV感染产生的经济负担超过800亿美元。自20世纪50年代hRSV被发现以来,国内外科研人员对hRSV疫苗进行了大量的研发,至今尚无被批准使用的hRSV疫苗。hRSV疫苗一直面临安全性不足或免疫原性弱等巨大挑战,已有多种进入临床试验阶段的hRSV疫苗宣布“失败”。2013年,融合前F蛋白（prefusion F protein,Pre-F）构象成功解析后,以Pre-F为基础的hRSV疫苗展现出良好的应用前景,目前已有14种疫苗处于临床试验阶段,包括减毒活疫苗、病毒载体疫苗、亚单位疫苗和颗粒疫苗等。本文就hRSV疫苗研发面临的挑战以及最新研究进展作一综述。     

呼吸道合胞病毒蛋白的研究进展

本文对呼吸道合胞病毒基因组编码的病毒蛋白,包括膜蛋白、核蛋白、融合蛋白、基质蛋白及非结构蛋白的结构和功能的研究进展进行比较全面的综述。     

人呼吸道合胞病毒疫苗的研究进展

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)是导致婴幼儿及老年人下呼吸道感染的主要病原体之一。hRSV基因组全长为15 222 bp,包含10个基因,共编码11种蛋白质(9种结构蛋白,2种非结构蛋白),不同蛋白在hRSV致病过程中发挥不同作用。随着对hRSV生物学和结构特性的深入研究,已研发出多种类型的hRSV疫苗,如hRSV减毒活疫苗hRSV?NS2/?1313/I1314L已进入Ⅱ期临床试验,hRSV亚单位蛋白疫苗Pre-F-GCN4t已进入Ⅲ期临床试验等。本文就hRSV的生物学特性及研制进展较快的hRSV疫苗类型作一综述,以期为我国hRSV疫苗的研发提供参考。     

人呼吸道合胞体病毒疫苗的研究进展

人呼吸道合胞体病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是导致全球婴幼儿细支气管炎及肺炎的主要致病原,造成严重的社会负担.目前还无上市预防RSV感染的疫苗.随着科技的不断发展,研究者已研发了许多不同类型的RSV疫苗,包括弱毒活疫苗、嵌合体疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗及纳米颗粒疫苗.本文就...     

呼吸道合胞病毒G蛋白研究进展

呼吸道合胞病毒G蛋白是该病毒的黏附蛋白,亚型间抗原结构高度变异,在病毒感染和诱导保护性免疫方面起到重要作用。本文对呼吸道合胞病毒G蛋白的结构、功能、免疫表位、CX3C模序及疫苗研制等作一综述。     

表达呼吸道合胞病毒F蛋白的新城疫重组病毒的构建及其免疫原性

目的利用新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)反向遗传系统构建表达呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F蛋白的重组病毒,并以BALB/c小鼠为动物模型,评价其免疫原性。方法在已建立的NDV反向遗传系统的基础上,将RSV F基因插入NDV全长cDNA克隆中,构建并拯救获得表达RSV F蛋白的重组病毒r LS/RSV-F。采用间接免疫荧光(indirect immunoinfluscent assay,IFA)法鉴定RSV F蛋白的表达;以HA、病毒半数鸡胚感染量(50%infective dose,EID50)、半数组织感染量(50%tissue infectious dose,TCID50)及生长曲线等生物学指标对其生物学特性进行鉴定;将r LS/RSV-F滴鼻免疫BALB/c小鼠,于免疫后第49天经眼眶后静脉丛采血,分离血清,ELISA法检测IgG抗体效价,中和试验检测中和抗体效价。结果成功拯救表达RSV F蛋白的NDV重组病毒r LS/RSV-F,具有与亲本病毒相似的感染能力及生长动力学特性;r LS/RSV...     

结核分枝杆菌TB10.4与呼吸道合胞病毒F1蛋白的融合表达

目的在大肠杆菌中融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)TB10.4蛋白与呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白。方法从MTB标准菌株H37Rv全基因组中扩增TB10.4(N/X)和TB10.4(N/B)基因,分别插入原核表达载体pET-28a和pET-30a中,构建重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4(N/B)/pET-30a;从F/18T/DH5α菌株中扩增F1(B/X)基因,与TB10.4(N/B)/pET-30a质粒连接,构建重组表达质粒TB10.4-F1/pET-30a;将质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a分别转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组TB10.4和TB10.4-F1蛋白相对分子质量约为13 000和59 000,可与鼠抗His单抗特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白TB10.4-F1,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒截短F1蛋白的原核表达及其免疫原性评价

目的原核表达重组人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,HRSV)A型Long株截短F1融合性蛋白,并评价其免疫原性。方法采用RT-PCR法扩增HRSV截短F1蛋白基因序列,克隆至pET-28b表达载体,构建重组原核表达质粒RSV F1/pET-28b,转化大肠埃希菌Shuffle T7菌株,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;用Ni亲和层析柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE及Western blot分析。将纯化的重组截短F1蛋白免疫ICR小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗体效价。结果重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的截短F1蛋白相对分子质量约44 000,主要以包涵体形式存在,纯度达90.6%。重组截短F1蛋白免疫小鼠血清抗体效价最高可达1∶4 096。结论原核表达的重组HRSV截短F1蛋白免疫原性好,为单克隆抗体的制备及检测试剂盒的研究奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒合胞体形成机制的研究进展

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属于副黏病毒科肺炎病毒亚科病毒,是一种引起人严重呼吸道疾病的病原体,主要感染婴幼儿、老年人及免疫缺陷的成年人。病毒合胞体的形成是RSV感染细胞导致细胞病变的最主要特征。有研究表明,RSV的受体黏合和促融合活力主要依赖2个不同的刺突结构,分别是吸附(G)糖蛋白和融合(F)糖蛋白,G糖蛋白的主要作用是促进RSV与靶细胞的吸附,而F糖蛋白的主要作用是促进病毒与细胞、细胞与细胞之间的融合。本文就近几年RSV合胞体形成机制的研究进展作一综述。     

人呼吸道合胞病毒蛋白F1片段在大肠杆菌中的表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白主要抗原表位集中的137～523 aa片段,并对其进行纯化,检测其免疫原性。方法采用RT-PCR扩增RSV F1基因片段,与pThioHisA载体连接,构建重组表达质粒pThioHisA-RSV F1,转化大肠杆菌Top10,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析;表达的融合蛋白经稀释复性、离子交换及亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析;将纯化的融合蛋白RSVF1经皮下多点注射分别免疫ICR小鼠,实验分为3组:RSV F1无佐剂组(RSV F1,50μg/只)、RSV F1佐剂组(50μg RSV F1+5μg nOMV佐剂)和阴性对照组(PBS,100μl/只),于第3周加强免疫1次,第4周尾静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测其免疫原性。结果经双酶切鉴定及DNA测序证明重组表达质粒pThioHisA-RSV F1构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约56 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占细胞总蛋白的36%;纯化的融合蛋白纯度可达95%,并可与RSV-F1多克隆抗体发生特异性抗原抗体反应;与阴性对照组相比,RSV F1免疫的小鼠血清特异性IgG水平明显提高(P<0.05)。结论已成功地在大肠杆菌中高效表达了RSV F1片段,纯化的融合蛋白在小鼠体内具有良好的免疫原性,为进一步研究RSV F蛋白亚单位疫苗奠定了基础。     

武汉地区呼吸道合胞病毒分离株的G蛋白基因遗传特征

目的分析武汉地区人呼吸道合胞病毒(RSV)分离株的G蛋白基因的遗传特征。方法使用不同的特异性引物,对武汉地区2006年分离的9株RSV进行G基因3′末端第2个高变区的序列测定,并进行基因分型和基因亲缘关系分析。结果分离的9株RSV中,33.3%(3/9)为A亚型,属GA2基因型;66.7%(6/9)为B亚型,其中1株属于BA基因型,5株属于GB8基因型。9株RSVG蛋白与原型株核苷酸同源性为84.5%～99.0%,且与原型株相比,在205～230位氨基酸中有5～8个位点氨基酸变异,还存在糖基化位点的改变。结论2006年初在武汉地区存在着由不同RSV株引起的传播链,A、B亚型共循环,B亚型是优势流行亚型;9株RSVG蛋白与原型比较,存在明显的差异。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒裂解条件的初步探索

目的对人呼吸道合胞病毒(HRSV)的裂解条件进行初步探索,为研制HRSV裂解纯化疫苗奠定基础。方法用不同的裂解剂,以不同浓度和温度对HRSV裂解不同时间,以HRSV的F及G蛋白为目标蛋白,对得到的蛋白进行还原蛋白电泳分析及Western blot鉴定,电镜观察验证裂解效果。结果1%浓度的TritonX-100在4℃作用90min,对HRSV的裂解效果优于其他裂解剂。电镜观察可见病毒样品呈云絮状裂解;Western blot分析表明,特异性条带为HRSV的F蛋白。结论已初步筛选出HRSV的裂解条件,其对HRSV的裂解效果较好。     

具有中和活性抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的　制备具有中和活性抗呼吸道合胞病毒的单克隆抗体。方法　采用杂交瘤技术制备单克隆抗体 ,并以ELISA结合免疫组化技术进行筛选。结果　获得 8株分泌抗呼吸道合胞病毒的特异性单克隆抗体的细胞株 ,其中 2株分泌的单抗具有中和活性 ,效价 1∶16 0和 1∶32 0。结论　成功制备出具有中和活性的呼吸道合胞病毒的单抗     

呼吸道合胞病毒表位重组蛋白F1-F/M2的原核表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达、纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)表位重组蛋白F1-F/M2,并检测其在小鼠体内的免疫原性,为RSV亚单位疫苗的研制、疫苗所致免疫病理反应机理的研究提供参考。方法利用定点突变技术对原核表达载体pGEX-6p-1进行改造,在其GST标签前制造一个HindⅢ酶切位点;从RSV long株中扩增F1片段,从质粒pET28a-G1-F/M2中扩增F/M2基因片段,并在克隆载体pUC19的辅助下,将F1-F/M2基因连接至改造后的pGEX-6p-1载体中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His-tag标签蛋白纯化试剂盒纯化后,经尿素浓度梯度透析复性,SDS-PAGE分析其纯度,BCA法检测其浓度,Western blot法分析其反应原性。将纯化的重组蛋白F1-F/M2经铝佐剂乳化后,经腹腔免疫BALB/c小鼠,共3次,间隔10 d,末次免疫后10 d,采用空斑减少试验检测小鼠血清、肺组织匀浆和鼻腔冲洗液中抗RSV中和抗体水平;取小鼠脾脏,分离脾单个淋巴细胞,采用ELISAPOT技术检测重组蛋白诱导产生IFNγ的细胞免疫水平。结果重组表达质粒pGEX-6p-1-F1-F/M2经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白F1-F/M2相对分子质量约为20 800,表达量约占菌体总蛋白的20%,几乎全部以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白的纯度约为90%,浓度为0.42 mg/ml,可与小鼠抗RSV血清发生特异性反应;重组蛋白F1-F/M2能诱导小鼠血清中产生较高滴度的中和抗体(1∶289),肺部组织匀浆中略弱(1∶242),鼻腔冲洗液中未检测到中和抗体;重组蛋白F1-F/M2免疫小鼠的脾淋巴细胞经体外抗原刺激能产生特异性IFNγ斑点。结论成功原核表达了表位重组蛋白F1-F/M2,纯化后的重组蛋白能诱导产生较高滴度的中和抗体及CTL应答,有望开发成RSV亚单位疫苗。     

呼吸道合胞病毒F1蛋白截短体(F_(212-489))的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白截短体(F212-489)。方法从质粒p MD-18T-f中PCR扩增截短f1基因(f212-489),经TA克隆测序正确后,将目的片段插入原核表达载体p ET-28a,构建重组表达质粒p ET-28a-f212-489,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒p ET-28a-f212-489经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为30 000,主要以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的10%;纯化的重组蛋白纯度为85%,可与羊抗RSV多克隆抗体特异性结合。结论成功表达了RSV F1蛋白截短体(F212-489),纯化的重组蛋白反应原性良好,为更好地研究RSV的免疫机理及通过基因工程方法研制特定部位的亚单位或多肽疫苗奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒培养及其病毒滴度检测方法的建立

目的确定呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)培养条件,筛选病毒保护剂配方,并建立检测病毒滴度的微量细胞病变方法。方法分别将Hep2、Vero和293R细胞以0.01 MOI接种RSV,选择病毒培养细胞基质;将RSV分别以0.005和0.02 MOI接种Hep2细胞,在4~9 d收获病毒液,检测病毒滴度,确定最佳MOI及病毒收获时间;将6种配方病毒保护剂分别加至病毒液中,反复冻融7次,检测病毒滴度,筛选最佳配方;将病毒分别在33和37℃条件下滴定,第7、9天判定结果,确定微量细胞病变方法的培养温度和判定时间。结果确定病毒培养细胞基质为Hep2细胞,以0.02 MOI RSV接种后,37℃培养7~9 d收获病毒液;配方1(0.1%人血白蛋白)为最佳病毒保护剂配方;微量细胞病变法的实验条件为37℃滴定,7 d判定结果。结论建立了稳定可靠的呼吸道合胞病毒培养及病毒滴度检测方法。     

腮腺炎病毒蛋白组分疫苗的免疫效果

目的观察腮腺炎病毒蛋白组分疫苗的免疫效果。方法SP株腮腺炎病毒液经灭活、浓缩、裂解后,采用SP SepharoseTM Fast Flow阳离子层析柱及Sepharose CL-4B分子筛层析柱纯化,收集各峰样品,经12%SDS-PAGE、Western blot分析及HPLC检测。并取第1峰样品免疫ICR及BALB/c小鼠,检测血清中和抗体效价及CTL杀伤活性。结果所收集的第1峰样品为单一的腮腺炎病毒蛋白组分。免疫ICR小鼠可诱导产生中和抗体,其免疫后各检测时间点的GMT水平与减毒活疫苗组相比,差异均无统计学意义;免疫BALB/c小鼠可诱导产生针对HN肽段的CTL杀伤活性,而减毒活疫苗组则未能诱导此特异性CTL反应。结论腮腺炎病毒蛋白组分疫苗在小鼠体内可诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答,为新型腮腺炎疫苗的研制提供了实验依据。     

人呼吸道合胞病毒与结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性

目的在大肠杆菌中表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的融合蛋白TB10.4-F1,检测其免疫原性。方法将重组工程菌TB10.4/pET28a/BL21和TB10.4-F1/pET30a/BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;表达的融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1经His TrapTMHP层析柱进行亲和层析一步纯化后,免疫BALB/c小鼠。小鼠分为TB10.4(30μg/只)、TB10.4-F1(30μg/只)及PBS(200μl)组,分别于0、2、4周免疫小鼠,于每次免疫前1 d经尾部取血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性的IgG水平;于末次免疫2周后摘眼球取血,分离血清,ELISA法检测特异性IgG水平及中和抗体滴度。结果表达的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1的相对分子质量分别约13 300和59 600,均以包涵体形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的53.9%和12%;纯化后的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1纯度分别可达95%和80%;与TB10.4组相比,TB10.4-F1组IgG水平明显升高,IgG1/IgG2a值明显降低,但仍大于1;TB10.4-F1组小鼠血清中RSV特异性中和抗体滴度可达log102.699。结论融合蛋白TB10.4-F1免疫原性强,能激发出较为平衡的Th1/Th2反应,并产生抗HRSV的中和抗体。融合蛋白TB10.4-F1有望成为预防HRSV感染的候选疫苗。     

呼吸道合胞病毒空斑检测方法的建立及应用

目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)空斑检测方法,并用于病毒滴度的定量。方法将不同稀释度的RSVA2株病毒液分别接种于Hep-2细胞单层,加0.6%营养琼脂糖覆盖,培养6d后用10%甲醛固定。去除覆盖层,0.05%中性红染色,按文献报道的方法进行空斑计数。建立空斑法测定RSV滴度的标准曲线,并验证空斑法的准确性及精密性,应用建立的空斑法检测RSV感染BALB/c小鼠肺组织中的RSV滴度。结果RSVA2株感染的Hep-2细胞出现典型的空斑,直径约1～3mm,形态呈圆形或类圆形。空斑法的最低检测限为3.4×101PFU/ml,线性关系良好,相关系数r=0.999996,准确性及精密性均良好。RSV感染的BALB/c小鼠肺组织标本均出现数量不等的空斑。结论所建立的RSV空斑测定方法敏感、准确,能稳定地对病毒滴度进行定量测定,为进一步研究RSV的感染性和免疫原性奠定了基础。