巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响

目的构建蛋白酶缺失菌株,提高外源蛋白质表达的分泌率与产量。方法构建质粒pRS306/PEP4 L&R,利用基因重组原理剔除巴斯德毕赤酵母中的PEP4基因。比较基因剔除前后外源蛋白质表达量的差异。结果剔除毕赤酵母中的PEP4基因后外源蛋白质表达量平均提高9．5%。结论剔除毕赤酵母中的PEP4基因可有效地控制外源蛋白质MIP表达时的降解。     

毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略

毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。     

源于 GAP 启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比, 源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇, 表达时间短, 并且在高密度发酵时采用连续发酵模式, 因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述, 以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

源于GAP启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比,源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇,表达时间短,并且在高密度发酵时采用连续发酵模式,因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述,以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

高效液相色谱法测定废毕赤酵母中氨基酸成分

巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统是近年来发展的一种优秀的真核表达系统，目前已有几百种蛋白在该系统中得到了表达。随着部分蛋白逐渐被应用到工业生产中，其生产中产生的废毕赤酵母的处理将越来越受到人们的重视。本文对实验研究产生的废毕赤酵母中的氨基酸成分进行了分析，为废毕赤酵母的综合处理提供了一条重要思路。     

蔗糖利用型毕赤酵母工程菌的构建

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近20年来应用最广泛的真核表达系统之一,已有500多种蛋白在该系统得到了成功表达,然而在毕赤酵母基因组中却缺少蔗糖酶基因,因此无法利用蔗糖。本研究从酿酒酵母基因组中克隆得到蔗糖酶基因SUC2。将SUC2亚克隆后得到表达载体pPICZαA-SUC2。经电转化后,表达载体整合进入毕赤酵母KM71H基因组,得到能够利用蔗糖的毕赤酵母工程菌。     

游离型质粒在毕赤酵母中表达人溶菌酶的研究

构建一种表达人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌。巴斯德毕赤酵母表达质粒多以整合型质粒为主,整合型毕赤酵母表达外源基因时,外源蛋白的表达量会随着基因整合拷贝数的增加而增加,而对于毕赤酵母而言,稳定的游离型载体更有利于进行外源基因突变文库的构建及高通量筛选。该文将来自乳酸克鲁维酵母中的自主复制序列(pARS)与酵母表达载体pPICZαA连接,得到游离型表达载体pPICZαA-pARS。将优化后的人溶菌酶基因hLYZ连接至该载体中,构建重组表达载体pPICZαA-hLYZ-pARS。重组载体经电转化以游离形式转入毕赤酵母菌株X33中。摇瓶发酵结果显示诱导72 h后,发酵上清液酶活性为340 U/mL。利用镍亲和层析从发酵上清液中纯化人溶菌酶,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定后纯化后的蛋白质量浓度为0.954 mg/mL。该研究成功构建了分泌表达具有生物活性的人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌,为日后利用现代生物技术突变获得更高抗菌活性、更广抗菌谱人溶菌酶的研究奠定了基础。     

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展

脂肪酶作为一种常见的工业用酶,广泛应用于食品、化妆品等与生活密切相关的工业领域,但较高的生产成本和使用成本,在一定程度上限制了其进一步应用。通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达系统重组表达脂肪酶,成为解决限制脂肪酶发展的方法之一。本文介绍了脂肪酶在P.pastoris表达系统中的异源表达及其优化策略,并对毕赤酵母表面展示异源脂肪酶的技术及应用进行了归纳。     

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展

脂肪酶作为一种常见的工业用酶,广泛应用于食品、化妆品等与生活密切相关的工业领域,但较高的生产成本和使用成本,在一定程度上限制了其进一步应用。通过巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达系统重组表达脂肪酶,成为解决限制脂肪酶发展的方法之一。本文介绍了脂肪酶在P.pastoris表达系统中的异源表达及其优化策略,并对毕赤酵母表面展示异源脂肪酶的技术及应用进行了归纳。      

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。     

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^K229L和ARO5,分支酸变位酶ARO7^G141S和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。     

抗菌肽DCD-1L的随机突变及在毕赤酵母中的表达

目的用毕赤酵母构建抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并使随机多肽在培养基中表达。方法用定向进化的方法在基因内部造成随机突变,然后将其构建到含有强启动子GAP和α-factor信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pGAPZαC中,线性化后转化到巴斯德毕赤酵母蛋白酶缺陷株SMD1168中,形成突变库。利用抗生素Zeocin筛选出阳性克隆,并用SDS-PAGE鉴定表达蛋白质。结果肽库库容达到7．8×10^3个cfu,在上清中鉴定出了表达蛋白。结论成功构建了抗菌肽DCD-1L的随机多肽库,并实现了在培养基上清中的表达。     

低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响

毕赤酵母表达系统是近年发展较为突出的表达系统之一.大量研究表明,低温诱导在毕赤酵母发酵过程中对促进细胞物质及能量代谢,提高胞内醇氧化酶活力及能量水平,降低细胞死亡率及蛋白酶作用有明显影响;此外,外源蛋白表达过程中的聚集与降解作用也与诱导温度有关.该文从诱导温度角度对重组毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展进行了综述.     

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。      

耐热β-半乳糖酶在乳酸克鲁维酵母及毕赤酵母中的表达研究

将嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖酶基因bgaB分别插入穿梭质粒pKLAC1、pPIC9k的α-因子信号肽下游,构建bgaB基因的乳酸克鲁维酵母真核表达载体pKLAC1-bgaB及毕赤酵母真核表达载体pPIC9k-bgaB。载体经酶切线性化后采用电击方法分别转化到乳酸克鲁维酵母K.lactis GG799及毕赤酵母GS115中,并通过同源区各自整合到宿主基因组中。重组酶进行镍柱纯化、Western Blot杂交鉴定及酶学性质分析。结果表明,耐热β-半乳糖苷酶在酵母表达系统中可以实现外源表达且热稳定性保持良好,但不能被酵母系统有效分泌。     

双亚基丹酚酸酯酶基因的表达载体构建及其生物转化

为了实现丹酚酸酯酶的外源性表达,利用了大肠杆菌和毕赤酵母两种表达系统,原核大肠杆菌采用p ET 28a和p ET 32a构建表达载体,并对重组大肠杆菌进行分别诱导表达和共表达;真核毕赤酵母采用p PIC9K构建共表达载体,对重组毕赤酵母进行诱导表达。研究结果表明,两种体系均能诱导表达出丹酚酸酯酶,蛋白在大肠杆菌系统中得到了高效表达,但未显示出该酶活力。毕赤酵母系统可使蛋白分泌性表达,表达产物具有一定的丹酚酸酯酶活力,但表达量不高。说明大肠杆菌系统体系更为适合大量表达丹酚酸酯酶,由此提供了一种该酶的外源表达方法。      

甲醇毕赤酵母Pichia methanolica的高效电转化方法

采用电穿孔的方法对甲醇毕赤酵母进行外源DNA的转化。通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索,建立了质粒pMETA-Lip对甲醇毕赤酵母PMAD16的高效电转化方法。结果表明,当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、质粒DNA浓度为30μg/mL、采用0.2cm电转杯、电压为600 V时,转化率达到最大值,为57个转化子/μg质粒DNA。经抽样鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。为外源基因在甲醇毕赤酵母中的表达奠定了基础。     

巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展

毕赤酵母生物表达系统已成功地表达了多种重组外源活性蛋白,广泛地被应用于能源、医疗、科学研究等方面的研究。综述了2008年以来毕赤酵母GS115基因组研究,以期从分子水平解释转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理,进而解决毕赤酵母发酵过程中产量低、过糖基化等瓶颈。      

共表达透明颤菌血红蛋白提高脂肪酶在毕赤酵母中的表达

为了克服巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中的溶氧限制,提高外源蛋白的表达量,本文以启动子YPT介导透明颤菌血红蛋白(VHb)在培养过程中组成型表达。同时以启动子AOX1介导的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因作为报告基因,使CALB在甲醇诱导阶段表达。另外,还将绿色荧光蛋白在过氧化物表面表达,将红色荧光蛋白在过氧化物基质中表达以检测信号肽能否定位在相应的位置。最后,将VHb分别在过氧化物酶体表面和基质两个位置表达,以观察表达位置的不同所产生的影响。通过SDS-PAGE和Western Blot分析表明,CALB和VHb在重组菌中成功实现了共表达。在限氧条件下,重组菌株GS115/ExVHb、GS115/VHbSKL的外源蛋白CALB的表达量比对照菌株GS115/CALB分别提高了27.57%和20.52%。这说明VHb与外源基因共表达可以改善酵母在发酵过程中的摄氧情况,提高外源蛋白的表达量。     

外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量。