肉制品中表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据表皮葡萄球菌16S基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的表皮葡萄球菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有表皮葡萄球菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/mL。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

食品中铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测的研究

根据铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个Taq Man探针,建立铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的铜绿假单胞菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,只有铜绿假单胞菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及Taq Man探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3 CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

应用多重实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌毒力基因

目的:建立一种快速、准确、简便的蜡样芽胞杆菌毒力基因检测方法,为蜡样芽胞杆菌更深入的研究提供依据和便利。方法:采用TaqMan探针法设计了三重hblA,hblC,hblD基因,三重nheA,nheB,nheC基因,三重ces,entFM,bceT基因的多重实时荧光PCR体系检测蜡样芽胞杆菌毒力基因。结果:多重体系对蜡样芽胞杆菌毒力基因的检测具有良好的特异性和灵敏性,其最低检出限为63 CFU/mL。结论:利用上述体系对蜡样芽胞杆菌的毒力基因进行检测能够省时省力,特异性、灵敏性良好,具有实际应用价值。     

基于实时荧光PCR技术鉴别梅花鹿

目的建立基于TaqMan实时荧光PCR技术鉴别梅花鹿的分析方法。方法通过对梅花鹿线粒体D-loop基因序列比对分析,选取梅花鹿D-loop基因特异位点作为扩增靶序列,设计梅花鹿特异性的引物和TaqMan探针,并用已知样本对引物和TaqMan探针的物种特异性、灵敏性进行验证。结果该引物和探针对梅花鹿成分检测具有较强的特异性,与其他物种DNA无交叉扩增,该方法的检测灵敏度为0.01ng/μL。结论本方法具有较高的特异性和灵敏度,适用于对肉类以及其他梅花鹿产品的物种的鉴别。     

食品中椰毒假单胞菌酵米亚种实时荧光PCR检测的研究

目的建立食品中椰毒假单胞菌酵米面亚种实时荧光PCR检测方法。方法根据椰毒假单胞菌酵米面亚种16S～23S rRNA基因片段序列,用Oligo7设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,摸索最佳退火温度,最佳引物和探针浓度,建立椰毒假单胞菌酵米面亚种实时荧光PCR检测方法。通过对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌以及22种其他标准菌株进行实时荧光PCR检测,验证本法的特异性和抗干扰性。同时从菌液浓度和DNA浓度水平上进行研究,确定该检测方法的灵敏度。结果用该方法检测23种菌,除唐菖蒲伯克霍尔德氏菌外,其他22种细菌均为阴性。抗干扰性试验显示杂菌对检测结果不影响,本法抗干扰能力强。通过灵敏度试验的研究,确定本法检测椰毒假单胞菌酵米面亚种的菌液灵敏度为1×10~2 CFU/mL,DNA灵敏度为250 fg/μL。结论本试验设计的引物和探针具有较强特异性、抗干扰性以及灵敏度,该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

基于环介导等温扩增技术的产呕吐毒素 蜡样芽胞杆菌特异性检测

本研究旨在建立食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速检测方法。基于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌合成酶基因cesB靶基因,设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),建立环介导等温扩增技术(LAMP)。然后采用2株产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌、19株蜡样芽胞杆菌和41株非蜡样芽胞杆菌验证了该LAMP具有很好的特异性。LAMP检测的灵敏度在DNA水平上达到1.49 pg/μL,纯菌的灵敏度为5×10~3 cfu/mL。人工污染米饭样品,当起始污染量为2 cfu/g时,37℃增菌培养6 h,用试剂盒法和煮沸法提取的DNA,都可以检出产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌。采用此LAMP方法进行了72份实际样品的检测,检出2份产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌阳性样品,与传统方法一致。因此,本研究建立的LAMP检测方法可应用于食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速特异检测。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌

建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法,根据已公布的蜡样芽孢杆菌hblA基因序列设计内外引物,并向反应体系中加入荧光染料SYBRGreen Ⅰ,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增技术（real-timefluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp）检测蜡样芽孢杆菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定。通过21 株致病菌验证RealAmp特异性,并比较了RealAmp与普通环介导等温扩增技术的敏感性,对人工污染的检出限进行了测定。结果表明对21 株致病菌进行特异性实验,4 株蜡样芽胞杆菌呈阳性结果,17 株非蜡样芽胞杆菌均呈阴性结果。RealAmp检测纯菌的灵敏度为8.2 CFU/mL,比普通环介导等温扩增技术的灵敏度高10 倍,人工污染牛乳RealAmp的检出限为8.2 CFU/mL。并且在20 min左右即可判定结果。该方法快速、准确、灵敏度高、操作便捷、可实时监控检测蜡样芽孢杆菌,有望成为快速检测蜡样芽孢杆菌的有效方法。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因方法的建立

建立克罗诺杆菌的特异、灵敏的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法。方法 根据GenBank公布的克罗诺杆菌MMS基因高保守序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,建立和优化反应体系,用25种其他常见致病菌评价反应体系的特异性,用克罗诺杆菌MMS基因重组质粒构建实时荧光定量PCR标准曲线,对重组质粒、纯菌和人工模拟污染样本进行灵敏度试验,并与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR比较,配对t检验分析两种方法对Ct值和荧光强度的差异。结果 采用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测克罗诺杆菌MMS基因仅需40min,与25种非目标菌无交叉反应,仅对克罗诺杆菌有特异性扩增;所构建方法线性关系良好,相关系数r²=0.999,扩增效率为99.972%,对重组质粒、纯菌、人工模拟污染样品标本的灵敏度分别达10拷贝/反应、3.8和38cfu/ml;与FDA推荐的TaqMan探针实时荧光PCR相比,TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR的Ct值更小、△Rn值更高,灵敏度和分辨率差异均有统计学意义(Ct:t=-14.406,P﹤0.01;△Rn:t=14.230,P﹤0.01)。结论 本研究建立的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR反应体系能够快速、特异、灵敏地检测克罗诺杆菌MMS基因,可用于婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的快速筛查和鉴定,具有较大的的应用价值和推广价值。     

恒温隔绝式PCR快速检测蜡样芽孢杆菌方法的建立及应用

该研究以编码旋转酶B亚基的gyrB基因为靶基因,利用恒温热隔绝式PCR（Insulatedisothermal PCR,IiPCR）,建立一种快速检测蜡样芽孢杆菌的方法。同时,将建立的方法与聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）和实时荧光定量PCR（SYBER Green Ⅰ荧光染料法和TaqMan探针法）检测方法相比较,并应用于不同类型零售食品中的蜡样芽孢杆菌检测。结果表明建立的检测方法能在40 min内迅速判定出结果（+、-、？）;与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、肠炎沙门氏菌等均无交叉反应,显示出良好的特异性;方法的最低检出限为1.5×102 CFU/mL,优于普通PCR,与实时荧光定量PCR检出限相当;对42份零售食品进行检测,共发现45.23%的样本被蜡样芽胞杆菌污染（19/42）。这一结果与常规PCR检测结果一致,但检测时间至少节省了4 h以上。该研究为蜡样芽孢杆菌提供了一种快速、便捷、特异性强、灵敏度高、适用于现场实时检测的检测方法。     

实时荧光PCR法检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的研究

近年来,包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的现象时有发生,运用国家安全标准方法进行检验,过程烦琐,周期较长,不利于监管。然而,实时荧光PCR检验法具有灵敏、快速、准确等优点,被广泛应用于各种检验检测中。本文采用实时荧光PCR法,利用特异性引物和探针对目标基因进行扩增。然后通过实时荧光PCR法对其他5种细菌和梯度含量的铜绿假单胞菌菌悬液进行检测,验证方法的特异性和灵敏度。结果表明,只有铜绿假单胞菌的实时荧光PCR检测结果为阳性,其他细菌的检测结果为阴性,说明本方法对铜绿假单胞菌的特异性较好,方法的灵敏度为1×10³ CFU·mL^-1。同国家安全标准方法相比,实时荧光PCR法所用时间更短,明显提高了检测效率。     

北极苹果结构特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法建立

目的为实现转基因北极苹果(Arctic~(TM) apple)目的标识管理,建立特异性实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法针对转基因北极苹果特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因北极苹果实时荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果建立的转基因北极苹果实时荧光PCR特异性强,定量检测限为20拷贝,扩增效率为96%,检测重复性良好。结论建立的特异性实时荧光PCR法可应用于转基因北极苹果的鉴定。     

驼乳中布鲁氏菌实时荧光PCR快速检测方法的建立

目的 建立驼乳中布鲁氏菌的实时荧光PCR快速检测方法。方法 根据布鲁氏菌外膜蛋白omp10基因的碱基序列,设计引物其探针,从模拟布鲁氏菌污染的驼乳中提取布鲁氏菌DNA片段进行实时荧光PCR扩增检测。结果 该方法从布鲁氏菌M5株中扩增出了特异性目的片段omp10,而对大肠埃希式杆菌等细菌的扩增结果均为阴性。经过10倍倍比稀释的模板进行检测,该方法的灵敏度为最低可检出2.31×10-4 ng/μL的DNA。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为0.9928,扩增效率E=0.97。结论 建立的实时荧光PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高的优点,为驼乳中布鲁氏菌病的早期预防及流行病学监测提供了有效的技术手段。     

传统发酵豆制品中3种致病菌的三重荧光PCR快速检测方法的建立

为了建立传统发酵豆制品中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光PCR快速检测方法。以单增李斯特菌hly A基因、蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因设计引物与TaqMan探针,通过优化PCR反应体系,建立了可同时检测单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光定量PCR体系,并进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法灵敏度高,特异性强,重复性好。对26株非目标菌进行检测,结果均为阴性,而定量检测批内和批间的变异系数均小于2%。单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌敏感性试验结果表明,这三种细菌的最低检测浓度分别为3×103cfu/mL、2×104cfu/mL、2×104cfu/mL。应用该方法可在8h内完成对样品中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的同步检测。     

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。     

三重微滴数字PCR定量检测即食米粉中致病菌方法研究

目的 建立三重微滴数字PCR(ddPCR)方法同时定量检测即食食品中的沙门菌、蜡样芽胞杆菌和单核细胞增生李斯特菌。方法 选择以沙门菌ttrA/ttrC、蜡样芽胞杆菌essC、单核细胞增生李斯特菌侵袭相关内肽酶基因等3个单拷贝基因对应的3对引物探针,采用实时荧光定量PCR验证引物/探针特异性后,建立三重ddPCR方法同时定量检测3种致病菌的拷贝数。结果 该方法的线性范围分别为：沙门菌25～22 687 copies/20μL;蜡样芽胞杆菌19～15 620 copies/20μL;单核细胞增生李斯特菌18～23 373 copies/20μL,线性相关因子r2≥0.999,6个浓度3次重复测定3种菌的相对标准偏差（RSD）≤12%,重复性好,对于上述菌株的最低检出限分别为6、3和7 copies/20μL;采用已建立的ddPCR方法和平板计数方法对模拟染菌米粉样品进行检测,两种方法测定值结果 RSD小于9%,结果一致性较好。结论 本研究建立的三重ddPCR同时定量检测即食食品中沙门菌、蜡样芽胞杆菌和单核细胞增生李斯特菌的方法与平板计数法相比,更快速、灵敏,结果准确。     

转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法的建立

为实现转基因大豆MON89788的标识管理,针对转基因大豆MON89788的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因大豆MON89788实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果显示：建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法能扩增出127 bp的产物,特异性强,灵敏度达到0.1%,约为40 个单倍体基因组拷贝,检测重复性好,可成功应用于实际样品检测。因此,建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法可以应用于转基因大豆MON89788大豆及其制品的检测。     

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猫源性成分

根据猫线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原酶亚基1（ND1）基因中的保守序列设计猫特异性引物和TaqMan探针,建立食品中猫源性成分的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。通过实时荧光PCR反复验证,结果表明,引物和TaqMan探针对猫源性成分的特异性良好,检测灵敏度可达1 pg,适用于食品中猫源性成分的快速鉴定。通过对随机抽取的市售肉制品的检测,尚未发现掺有猫源性成分的行为。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明:该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到10~4 CFU/m L。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25份市售实际样品进行测试,有5份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

实时荧光PCR法鉴定食品中双歧杆菌

根据双歧杆菌属16S rRNA基因的保守区序设计特异性引物和探针,建立一种鉴定食品中双歧杆菌属的实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法。对方法的特异性、灵敏度、重复性和体系抗干扰能力进行验证,最后采用该方法对市售25 份标示含双歧杆菌样品进行检测。结果表明：该检测方法可特异性检测双歧杆菌属细菌,对近缘的乳杆菌属、链球菌属及食品中常见菌群包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等均无扩增。双歧杆菌DNA检测绝对灵敏度可达到2 pg,相对灵敏度可达到104 CFU/mL。重复性测试表明相对标准偏差小于1%。同时进行了杂菌干扰检测实验,在培养物水平和纯基因组DNA水平上将青春双歧杆菌ATCC15703与大肠杆菌ATCC25922混合进行检测,检出Ct值较纯菌检测时无显著影响,表明建立的荧光PCR方法抗干扰能力良好。对25 份市售实际样品进行测试,有5 份标识含有“双歧杆菌”的样品未检测出双歧杆菌成分。本研究所建立的实时荧光PCR法能准确、快速检测食品中双歧杆菌属细菌。     

枣褐斑病菌实时荧光PCR快速检测方法研究

根据枣褐斑病原菌链格孢子基因组保守序列,设计特异性引物和双荧光标记探针,建立了枣褐斑病菌的TaqMan实时荧光PCR检测方法。此外,还对其他2种红枣植物病害病原菌和6种链格孢菌种进行了荧光PCR检测。结果表明,只有枣褐斑病菌产生荧光信号,其他病原菌均没有荧光信号产生。与常规PCR相比,TaqMan实时荧光PCR检测特异性强,灵敏度高,能检测到浓度为1.4pg/μL的DNA样本。该方法全程不必通过病原菌的分离与纯化培养,可直接用于病变样品的检测以及枣褐斑病的筛查与动态监测,适合枣褐斑病的快速诊断和分子监测。