溶藻弧菌引起暴发型食物中毒的病原学研究

为研究一起食物中毒的病原 ,对分离的可疑菌进行了培养、鉴定、动物毒力实验及ST毒素测定 ,结果显示分离菌为溶藻弧菌 ,该菌对小白鼠的LD50 为 3× 10 7CFU g鼠体重 ,存在ST毒素 ,证明这起食物中毒的病原为溶藻弧菌。     

海水中溶藻弧菌的分离、鉴定及其耐药性分析

用无菌采样器在上海临港海域采集100份海水,经过增菌培养和选择性分离后,进行3种生理生化鉴定和PCR鉴定,共得到33株溶藻弧菌。采用优化的K-B法测定分离菌株对20种抗生素的耐药性,结果表明:溶藻弧菌对四环素的耐药性最高（100.0%）,其次是氨苄青霉素（97.0%）和羧苄青霉素（93.9%）;对头孢吡肟、安曲南、红霉素、环丙沙星、诺氟沙星和氯霉素敏感。本次分离的溶藻弧菌具有严重的多重耐药性,所有分离菌均对3种及3种以上抗生素多重耐药,同时对6种及6种以上抗生素耐药的有15株（45.5%）,同时对8种及8种以上抗生素耐药的有6株（18.2%）。本次关于溶藻弧菌对抗生素的耐药性分析结果可以为食源性疾病控制提供参考依据,同时为溶藻弧菌的耐药机制的研究奠定理论基础。      

蛭弧菌对溶藻弧菌的消除作用研究

本实验研究了盐度(NaCl浓度,以下同),Ca2+和Mg2+)对海洋蛭弧菌5#-12和5#-sh06生长活性和裂解溶藻弧菌能力的影响,测定了两株蛭弧菌对11株致病性溶藻弧菌的裂解谱,同时研究了其对牡蛎养殖水体和肠道中溶藻弧菌的清除作用.结果表明,在1.0-3.5%的盐度范围内,蛭孤菌均能生长,最适盐度为3.0%;ca2+和Mg2+浓度为3mM时,5#-sh06具有最好的生长活性,而5#-12在Ca2+和Mg2+浓度为4mM时生长活性达到最强;Ca2+和Mg2+浓度为4 mM时,蛭弧菌5#-12和5#-sh06的裂解能力平均分别提高了11.8%和22.6%;5#-12和5#-sh06分别能裂解其中9株和10株溶藻弧菌,而两株蛭弧菌协同作用,能裂解全部11株溶藻弧菌;蛭弧菌能够有效降低牡蛎肠道和养殖水体中弧菌的数量,试验第7 d,实验组牡蛎肠道和养殖水体中弧菌浓度对数值比对照组分别低7.24和7.97.本研究结果揭示了蛭弧菌作为生物消除剂在控制和消除食源致病性溶藻弧菌等病原菌方面具有潜在的应用价值.     

海产品中溶藻弧菌的分离及多种方法鉴定效果的比较

目的了解北京市市售海产品中溶藻弧菌的污染情况,并对使用不同方法鉴定溶藻弧菌的效果进行比较。方法样品经碱性蛋白胨水增菌后,分别于硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(TCBS)琼脂培养基和科玛嘉弧菌显色培养基上划线培养,实时荧光聚合酶链式反应(PCR)法鉴定可疑菌落。以rpoB基因测序方法为参考,比较了实时荧光PCR和VITEK两种方法的鉴定效果。结果对北京市水产品市场随机采集的116份海产品进行了检测,实时荧光PCR法鉴定出溶藻弧菌阳性样品95份,检出率高达82%。使用科玛嘉弧菌显色培养基的检出率高于TCBS培养基,分别为82%(95/116)和72%(83/116)。经rpoB基因核苷酸序列测定确定95株疑似菌株为溶藻弧菌。采用VITEK 2 COMPACT GN鉴定卡对这95株菌株进行鉴定,31株鉴定为溶藻弧菌,其余未能得到准确的鉴定结果。结论北京市市售海产品中溶藻弧菌检出率高。科玛嘉弧菌显色培养基比TCBS琼脂培养基更适于溶藻弧菌的分离,实时荧光PCR法的鉴定效果优于VITEK法。     

应用蛭弧菌清除牡蛎中潜在致病弧菌的研究

本实验以从深圳湾海底沉积物中分离得到的两株蛭弧菌菌株506、菌株512,对31株常见的牡蛎致病弧菌进行了裂解能力实验,探索了它们的裂解谱。结果表明,蛭弧菌506可裂解31株试验宿主菌中的29株,512则可以裂解其中24株,而两株蛭弧菌的协同裂解能力高达100%。该结果展示了蛭弧菌在消除牡蛎致病菌及牡蛎活体内残留食源性致病菌的可行性。此外,我们测定了盐度对这两株蛭弧菌生长情况的影响,结果表明在10-45‰的盐度范围内,蛭弧菌均能生长,最适盐度为30‰;同时我们还研究了其对牡蛎养殖水体和肠道中副溶血弧菌的清除作用,数据表明蛭弧菌可以有效地清除牡蛎养殖环境和体内的副溶血弧菌,试验第7d,实验组水体中和牡蛎肠道副溶血弧菌浓度对数值比对照组分别低5.59和3.39,显示了其在清除牡蛎中弧菌的能力。     

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌（VA）的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。      

副溶血弧菌菌株229基因组测序及其致病因子的注释

本文对从冰冻海鱼中分离到的副溶血弧菌菌株229进行基因组测序,并对注释的基因进行功能聚类分析,以分析其致病因子,为研究其致病机制提供基因组全局水平的数据支持。完成了副溶血弧菌菌株229的基因组测序及组装,所得基因组4.97 Mb,GC含量为43.90%。基因注释获得4940个蛋白质编码基因(CDS),其中1304个CDS具有GO功能注释。WEGO注释显示大量CDS对于副溶血弧菌入侵宿主及随后的代谢过程发挥重要作用。获得了与副溶血弧菌致病性相关的致病因子,包括溶血素(hemolysin)、Ⅲ型因子(TypeⅢsecretion system,TTSS),这些因子位于不同的染色体位点,形成独立的致病因子簇。副溶血弧菌菌株229基因组组装和功能注释为研究副溶血弧菌致病性的遗传学基础提供了有价值的数据。     

海产品中副溶血弧菌的分离和PCR检测

为了建立一种快速、特异的PCR方法检测副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp),根据Genebank库中收录的Vp的tlh基因序列进行引物设计,应用PCR技术扩增tlh基因。利用TCBS和TSI2种选择性培养基从海产品总分离出68株疑似副溶血弧菌,经生化鉴定68株均为副溶血弧菌。用Chelex100法提取基因组DNA,进行tlh基因的PCR检测,tlh基因在不同副溶血弧菌中都广泛存在,而大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌等其他食源性致病菌均为阴性。tlh基因具有种属特异性,因此可以用来检测副溶血弧菌。     

响应面法优化溶藻弧菌的培养条件

通过单因素实验确定pH、温度、盐度三个因素下溶藻弧菌的最优培养条件。根据Box-Behnken中心组合实验原理进行响应面分析,以菌液的OD600为响应值,确定影响溶藻弧菌培养的各因素水平。结果表明,最优培养条件为pH7.62、温度34.55℃、盐度3.22%;菌体生长过程中pH和温度、温度和盐度对V.a ATCC17749生长的交互作用显著。     

副溶血性弧菌和溶藻弧菌的双重PCR检测技术

主要针对副溶血性弧菌(Vp BJ1997)和溶藻弧菌(Va ATCC17749)的gyrB基因的不同位点设计特异性引物,利用双重PCR技术同时检测Vp(BJ1997)和Va(ATCC17749),并对该反应体系的特异性以及灵敏度进行检测。结果显示Vp(BJ1997)灵敏度的检测下限可达2×10~2CFU/mL,Va(ATCC17749)灵敏度的检测下限可达2.03×10~2CFU/mL,双重PCR与单一PCR检测的灵敏度的数量级是相同的;与沙门氏菌(ATCC27892)、金黄色葡萄球菌(ATCC13565)、大肠杆菌(35218)、河弧菌(H265)、鳗弧菌(M936)、创伤弧菌(ATCC27562)无交叉反应;在人工污染试验中,混合菌液的检测下限2.84×10~3CFU/mL,而进一步稀释至2.84×10~2CFU/mL时,Vp(BJ1997)已检测不出,Va(ATCC17749)仍可检出。研究表明,该方法特异性强,灵敏度高,操作简单,成本低,检测速度快,为基层单位同时检测副溶血性弧菌和溶藻弧菌提供了一种快速准确的方法,对控制水产品中这两种致病性弧菌具有重大的意义。     

副溶血弧菌毒力因子及致病机理的研究进展

副溶血弧菌为一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌,是引发人食源性疾病的主要致病菌之一,主要分布在海洋环境中。副溶血弧菌的毒力因子主要包括黏附因子、侵袭因子、溶血性毒素、尿素酶、脂多糖、外膜蛋白、蛋白酶、Ⅲ型分泌系统和摄铁系统等。本文就副溶血弧菌的主要毒力因子及其致病机理的研究进展进行综述,可为进一步研究该菌的分子致病机理、制定快速精确的检测方法等提供参考。     

关于进境冻大马哈鱼携带溶藻弧菌的风险分析

按照WTO的SPS协定原则，分别对进境冻大马哈鱼携带溶藻弧菌可能对人体安全和水产动物健康造成的影响及其传播进行了风险评估。结果得出溶藻弧菌危害性较小，可允许其有条件地进境加工，提出了在加工过程中作消毒处理等建议措施。     

水产品中致病性弧菌污染状况研究

目的了解水产品中致病性弧菌污染状况。方法采用实时荧光PCR方法对样品中的致病性弧菌进行初筛,阳性样品用传统培养法确证。结果检测了海产品、淡水水产品共12类1 356份样品,未检出致病性的O1群霍乱弧菌,但有非O1群霍乱弧菌存在;海产品的虾类、蟹类、贝类、软体类带副溶血性弧菌率高。结论珠海地区水产品中弧菌污染较为普遍,且存在着多重污染现象。     

Two-stage Nested PCR Effectiveness for Direct Detection of Vibrio vulnificus in Natural Samples

The nested primers designed to amplify a 222-base pair portion of the hemolysin gene, vvhA, were specific for all V. vulnificus strains tested. The nested PCR amplification, coupled with direct extraction of template DNA, revealed improved sensitivity sufficient for detection of 1 to 10 CFU V. vulnificus in 1 mL of seafood homogenates, and eliminated the need for enrichment culturing. Thereby, the nested PCR method achieved a broader applicability, making it effective for extensive use in identification of the pathogen in natural samples such as raw seafoods, seawater and sediments.     

食品副溶血性弧菌检验方法的合作研究

比较食品副溶血性弧菌检验国家标准GB/T4789.7-2003和修订法的检测效果。采用两种方法对3类食品(牛肉馅、冻鳕鱼和牡蛎肉)检测3个染菌水平,染菌试样共213份。结果显示,国标法和修订法对染菌试样的检测阳性数分别为47和83。对于3类食品的3个染菌水平,统计学检验结果提示,修订法的检测效果等同或优于国标法。     

乙醇促进副溶血性弧菌直接耐热溶血素的基因表达

研究乙醇对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)直接耐热溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)产生和它的编码基因tdh表达的影响。以0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、8.0%乙醇处理2株带有tdh副溶血性弧菌ATCC33847和SZ32,研究对副溶血性弧菌有氧或者无氧生长的影响。选取1.0%乙醇处理来研究TDH产量和tdh表达变化。使用TDH抗血清试剂盒测定副溶血性弧菌培养液上清中TDH水平;使用荧光定量PCR方法分析tdh基因表达状况。低浓度(0.5%、1.0%、2.0%)乙醇存在时,副溶血弧菌菌株的生长未受到显著影响,乙醇浓度4.0%时副溶血性弧菌生长受到明显抑制,8%时未见有细菌生长。1.0%乙醇处理副溶血性弧菌培养液上清中TDH水平较未处理显著上升。胞内tdh表达水平升高,ATCC33847在有氧和无氧时分别升高到6.6倍和5.7倍,SZ32在有氧和无氧时分别升高到5.9倍和8.6倍。乙醇能够促进tdh基因表达从而使得TDH蛋白产量升高。本研究还比较了甲醇、乙醇、正丙醇对tdh表达的影响,发现它们对tdh表达均具有促进作用但相互之间没有明显差异。     

北京口岸进口鲜活海产品中副溶血性弧菌致病性分析

目的调查从北京口岸进口的鲜活海产品中是否存在致病性副溶血性弧菌。方法对2005年从北京口岸进口的鲜活海产品中分离的267株副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的尿素酶活性、神奈川现象和毒性基因（tdh和trh）进行了检测。结果267株副溶血性弧菌中27株尿素酶呈阳性，其中14株菌tdh基因和砌基因呈阳性。tdh基因和trh基因呈阳性的14株菌中有10株菌神奈川现象为阳性，并且全部分离自从加拿大进口的象拔蚌。结论北京口岸进口的鲜活海产品中存在致病性副溶血性弧菌，主要集中在象拔蚌中。应对从加拿大进口的象拔蚌加强监管，防止致病性副溶血性弧菌引起食物中毒发生。     

基于环介导等温扩增法(LAMP)检测上海市售贝类产品中副溶血性弧菌的毒力菌株

基于环介导等温扩增法(LAMP)对上海市8-10月市售贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株(tdh和trh毒力基因)进行检测分析,共检测贝类样品180份,6个常规品种,实验同时采用PCR测定方法进行对比。结果表明,含tdh和trh毒力基因的副溶血性弧菌在市售贝类中的检出率分别是12.77%和11.66%,PCR的分析结果为11.11%和7.78%。对分离的毒力菌株进行血清型分型后发现了2株O3:K6型副溶血性弧菌,其中1株为毒力基因双阳性菌(tdh+/trh+)。2株O3:K6型副溶血性弧菌的PFGE条带型相似度较高(相似度90%)。这些结果表明上海市售贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株存在一定的污染,应引起足够重视。双阳性O3:K6型副溶血性弧菌的出现值得关注,应对各血清型菌株尤其是O3:K6型副溶血性弧菌的流行情况加强监测。PCR检测结果对比分析表明,LAMP方法适用于贝类产品中副溶血性弧菌毒力菌株的检测分析。     

Western 斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌

目的：对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的直接耐热溶血毒素(thermostable direct hemolysin,TDH)进行分离纯化,建立Western 斑点印迹法技术检测致病性副溶血弧菌的方法。方法：用直接耐热溶血毒素免疫小鼠得到特异性抗血清,利用棋盘方法确定免疫血清最佳工作浓度,并对致病性与非致病性副溶血弧菌分别进行特异性测定。结果：最佳免疫血清最佳工作浓度为1:3200;检测致病性副溶血弧菌为阳性,非致病性副溶血弧菌属呈阴性。结论：Western 斑点印迹法技术可以特异性检测致病性副溶血弧菌,灵敏度高、操作简单,可用肉眼判定结果。     

Detection,Identification, and Prevalence of Pathogenic Vibrio parahaemolyticus in Fish and Coastal Environment in Jordan

Vibrio parahaemolyticus is widely distributed in the marine environments and considered the leading cause of human gastroenteritis in Asian countries. A total of 150 marketed fish and 50 water and sediment samples from the Gulf of Aqaba were examined for the prevalence of pathogenic strains of V. parahaemolyticus. A total of 132 typical isolates obtained from the primary selective medium (thiosulfate‐citrate bile salt sucrose agar) and showed positive biochemical properties were subjected to confirmation by polymerase chain reaction targeting the gyrB and toxR genes. These genes were confirmed at rates of 82% (108 isolates) and 72% (95 isolates), respectively. The toxR positive isolates were tested for the presence of thermolabile hemolysin (tlh), thermostable direct hemolysin (tdh), and tdh‐related hemolysin (trh) virulence genes. Accordingly, the prevalence rates of pathogenic V. parahaemolyticus were 4%, 8%, and 12% in sediment, water, and fish samples, respectively. The 16S rRNA amplification and sequences were conducted for confirmation of the isolates and showing the relatedness among these isolates. The results showed that both 16S rRNA and toxR assays had same sensitivity and tested isolates had high nucleotide similarity irrespective of their sources.