重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽在大肠杆菌中的表达纯化及功能鉴定

本研究构建了编码重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽基因的原核表达载体pET28a-rhCⅠ,并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。采用PCR的方法扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的cDNA序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a上;重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。利用SDS-PAGE和WesternBlot检测表达产物。大量表达重组蛋白,采用镍亲和层析进行纯化,并对纯化后的蛋白进行体外抗氧化研究以及促细胞增殖分析。结果表明,通过大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达获得了分子量约为40ku的重组蛋白,与预期相符。经镍亲和层析获得纯度较高的蛋白,通过DPPH实验证明其有一定的抗氧化活性;而且MTT实验证实该蛋白可以促进小鼠成纤维细胞3T3细胞的增殖,为其在食品、化妆品和医疗行业的应用提供一定的理论依据。     

类人胶原蛋白—锌螯合物的制备及相关研究

为了获得生物利用率高且生物安全性良好的补锌制剂,本文采用水体系合成法制备类人胶原蛋白（human-like collagen,HLC）-锌螯合物,考察pH值和配位比对锌螯合率的影响,并通过紫外—可见吸收光谱和傅立叶红外光谱研究该锌螯合物。优化的最佳工艺条件为：体系pH值6.0且类人胶原蛋白与ZnSO4的质量比10∶4。光谱研究结果表明,类人胶原蛋白和Zn2＋之间存在相互作用,生成的锌螯合物是一种不同于HLC的新化合物;羰基和亚氨基均参与HLC-Zn螯合物的形成过程,且该螯合物保持HLC分子原有的α-螺旋结构。因此,本文的研究结果为类人胶原蛋白—锌螯合物的大规模制备和进一步研究开发做出了有益探索。     

信号肽及发酵条件优化促进胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中分泌表达

胶原蛋白独特的三股螺旋结构,使其具有良好的力学性能和生物相容性,在生物医学材料等方面有广泛应用。利用微生物表达重组胶原蛋白,具有发酵周期短、成本低、便于遗传操作等优点,近些年发展迅速,但分泌带有三股螺旋结构的重组胶原蛋白仍是研究的难点。该研究以来源于化脓性链球菌的胶原蛋白V-B为对象,搭建了谷氨酸棒杆菌分泌表达重组胶原蛋白的平台。在重组胶原蛋白V-B前端引入6种不同信号肽(CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052或TorA),构建重组表达载体,并转入食品级表达宿主谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032中,结果显示PorB信号肽介导的分泌效果最好。此外,对PorB信号肽介导的分泌表达进行培养基、起始诱导菌浓度、诱导时长、IPTG浓度、溶氧的优化,最终胶原域B在摇瓶水平产量达到30 mg/L,是优化前的3倍,并通过圆二色谱表征,验证其正确折叠为三股螺旋。该研究为重组胶原蛋白在谷氨酸棒杆菌中的高效分泌表达奠定了基础。     

重组胶原蛋白制备及其应用研究进展

胶原蛋白由于其独特的理化性质和生物功能,在食品、化妆品、生物医学等领域的应用日益广泛。然而,从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险,限制了其许多潜在用途的开发。重组(类)胶原蛋白具有与天然胶原蛋白相似的性质和功能,近年来,国内外学者对重组(类)人胶原蛋白的表达进行了广泛的研究。本文综述了近年来重组(类)人胶原蛋白表达、分离纯化和应用方面的研究进展,为该重组蛋白的制备提供指导意义。      

海洋细菌Pseudoalteromonas sp.NJ631胶原蛋白酶的克隆与表达

对交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.NJ631基因组中潜在的胶原蛋白酶基因进行克隆与表达,并鉴定重组蛋白PNJC的酶活力。根据NJ631基因组序列草图,利用基因组信息发掘方法获得胶原蛋白酶功能提示的编码基因,进而利用高效表达质粒p ET28a构建重组表达系统。经IPTG诱导表达、亲和层析纯化获得重组蛋白纯化产物。以不溶性Ⅰ型胶原蛋白为底物,测定胶原蛋白酶酶活力。对Pseudoalteromonas sp.NJ631基因组信息挖掘,从中发现一条疑似编码胶原蛋白酶的基因序列,命名为Pnjc。该基因全长1 359 bp,GC含量45.62%,编码由452个氨基酸残基组成的约51 000大小的胶原蛋白酶。SDS-PAGE检测表明,胶原蛋白酶PNJC在0.2 mmol/L的IPTG诱导下得到高效表达。经过亲和层析获得纯化重组蛋白PNJC,蛋白质质量浓度约为1 mg/m L。酶活检测表明,PNJC的酶活力为160.34 U/mg,为标准品的70.48%。PNJC高酶活力表明,Pseudoalteromonas sp.NJ631来源的胶原蛋白酶具有重要的研究价值与工业开发潜力。     

富脯氨酸胶原蛋白的重组表达及热稳定性研究

细菌胶原蛋白制备工艺简单、成本低,在食品、医药材料等领域有着广泛的应用前景,但细菌胶原蛋白的热稳定性低,限制了其应用.该文以截短的酿脓链球菌胶原蛋白Scl2序列为研究对象,通过嵌合富脯氨酸序列,构建了表达高热稳定性重组胶原蛋白的大肠杆菌基因工程菌,并对重组菌株的发酵条件进行优化.结果 表明,在诱导菌体浓度为OD600值...     

类人胶原蛋白表达的优化与纯化的研究

将pET22b-COL6A2重组质粒,转入表达宿主菌大肠杆菌中,通过摇瓶实验优化重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件。结果表明:50mL LB（Amp）培养基（pH7.0）,接种量为5%,培养至OD值为0.7时,添加1mmol/LIPTG,诱导表达8h时原蛋白的表达量最高,为21.2%,并以Sepharose 6 Fast Flow对其进行纯化,得到纯度为90%以上的重组胶原蛋白。      

基于不同提取方式的鱼皮胶原蛋白对重组鱼肉品质的影响

为了提高淡水鱼糜制品的品质,本研究以草鱼为原料,用盐法、酸法和碱法提取鮰鱼皮中的胶原蛋白,探究其对重组鱼肉品质的影响及作用机制。通过对重组鱼肉的凝胶强度、TPA质地特性(硬度和咀嚼性)、析水率以及白度值的分析变化,综合评判胶原蛋白对重组鱼肉品质的影响,并通过化合作用力、蛋白质溶解率和TCA可溶肽含量,以及石蜡组织切片和SDS-PAGE探究了鱼皮胶原蛋白在重组鱼肉中的作用机制。结果发现:胶原蛋白显著提升了重组鱼肉的品质特性,提升效果为碱法酸法盐法;而其作用机制也有差异:碱溶性胶原蛋白与鱼糜凝胶的过程中不仅形成二硫键,且活化了內源转谷氨酰胺酶(TG)生成较多非二硫共价键,增强了凝胶网络结构;酸溶性胶原蛋白在凝胶时形成了二硫键,增强凝胶作用力;而盐溶性胶原蛋白与鱼肉蛋白形成的高分子物质增强了凝胶网络结构。     

重组人胶原蛋白微生物限度检查方法的建设及验证

目的:建立重组人胶原蛋白原料的微生物限度检测方法及控制菌检测方法,并进行方法学验证,用于重组人胶原蛋白原料的质量控制。方法:依据《中国药典》2015版四部通则1105和1106,对重组人胶原蛋白原料需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数进行检测,并对控制菌进行检测。结果:连续3批重组人胶原蛋白原料回收率范围在0.8-1.2之间,符合规定;控制菌检测方法符合规定。结论:重组人胶原蛋白需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数检测采用直接接种法,控制菌检测采用常规法。     

人源Ⅲ型胶原蛋白在毕赤酵母中的多拷贝重组表达、鉴定及抗氧化活性分析

胶原蛋白在人体内有重要作用,并且在食品、保健品、医疗等方面有广泛应用。该研究针对毕赤酵母的密码子偏好性对人源Ⅲ型胶原蛋白基因进行了密码子优化,在此基础上构建了人源Ⅲ型胶原蛋白单串联、二串联和二串联四拷贝表达载体pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2和pPIC9K-COL3-4,转化毕赤酵母GS115实现了人源Ⅲ型胶原蛋白的整合表达,获得了胶原蛋白单串联、胶原蛋白二串联和胶原蛋白二串联四拷贝的毕赤酵母工程菌株。对pPIC9K-COL3-S、pPIC9K-COL3-2重组菌株进行了摇瓶模拟高密度发酵,甲醇诱导浓度为0.5%,经SDS-PAGE和Western Blot检测,重组菌株成功表达了重组胶原蛋白,其中单串联蛋白表观分子量约为26.7 ku,双串联蛋白表观分子量约为52.3 ku。四拷贝重组菌株在0.5%甲醇诱导下的高密度摇瓶发酵产量最高,在最佳诱导时间为72 h时,蛋白产量达到约0.45 g/L。通过镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白,抗氧化活性实验表明,重组胶原蛋白DPPH自由基清除率达到51.49%、ABTS自由基清除率达到41.24%,证明具有抗氧化活性,为其在食品,保健品和医疗领域的应用提供理论依据。     

基于微流控芯片的毕赤酵母微胶囊收集系统构建

微流控技术已成为目前发酵工程中筛选和表征微生物性能的重要方法.本研究从微流控技术的理论出发,将计算流体力学、颗粒-流体两相流动和牛顿运动定律理论用于粒子追踪模型,建立了毕赤酵母微胶囊收集过程的数学模型.借助仿真软件模拟了毕赤酵母微胶囊的收集过程,设计了微流控芯片中收集器结构,并进行了进一步的数值模型模拟,最后搭建了用于...     

毕赤酵母产伏马毒素B1羧酸酯酶发酵条件和培养基的优化

为提高毕赤酵母重组菌产伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)羧酸酯酶的摇瓶发酵水平,以酶活力为指标,对发酵条件和培养基进行优化。通过单因素试验对发酵条件进行优化。通过Plackett-Burman试验筛选出关键培养基成分,再进行正交试验建立试验数据样本,最后建立误差反向传播神经网络模型进行预测并寻找最优发酵培养基组成。经优化得到的发酵条件:诱导温度28℃,初始p H 6.0,每24 h补加体积分数为1%的甲醇,诱导96 h;优化后发酵培养基组成:蛋白胨23 g/L、KH2PO444 g/L、PTM4 (Pichia trace minerals 4)微量元素溶液1.5 m L/L、K2SO47.15 g/L、Mg SO4·7H2O 5.85 g/L和酵母粉5 g/L。FB1羧酸酯酶酶活力达到402 U/m L以上,较优化前提高了1.19倍。优化后显著提高了重组菌株的产酶能力,研究结果为FB1羧酸酯酶发酵罐优化提供了基础数据。     

一株高产金属硫蛋白枯草芽孢杆菌的诱导发酵条件优化

金属硫蛋白为一类广泛存在于生物体内的多功能诱导性蛋白,具有转运储存金属离子、清除自由基、激活（失活）锌调节蛋白等功能,近年来已成为研究与开发的热点。本文以一株基因重组枯草芽孢杆菌为实验对象,对其诱导表达金属硫蛋白发酵条件进行研究。结果表明,枯草芽孢杆菌最优生长条件为:培养温度37℃,培养基初始p H7,摇床转速220 r/min,接种量4%;最佳诱导发酵条件为:菌液OD₆₀₀=3.9,IPTG终浓度1 mmol/L,摇床转速220 r/min,诱导时间48 h,诱导金属Cd²⁺终浓度为50μmol/L,发酵培养基无机盐为1%MgSO₄、碳源为2%蔗糖、氮源为1.5%酵母浸出物+胰蛋白胨+氯化铵（2∶2∶1）,枯草芽孢杆菌MT表达量达到最高为0.135 mg/m L。本研究为开发天然、高效海洋源金属硫蛋白提供了一定理论依据。      

卷枝毛霉SN2017发酵产银杏黄酮条件优化

以银杏内共生真菌卷枝毛霉（Mucor circinelloides）SN2017为研究对象，总黄酮产量为响应值，采用单因素试验及响应面法对其产黄酮的发酵工艺条件进行优化。结果表明，卷枝毛霉SN2017产黄酮的最优发酵工艺条件为：初始pH值5.5、发酵温度30 ℃、接种量9.7%、通气量6.5 L/min，在此最优条件下，总黄酮产量为56.63 mg/L，较优化前提高8.09%，为规模化生产提供了理论和实践的基础。     

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究

考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。     

1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD在肺炎克雷伯氏菌中的表达研究

以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组为模板,PCR扩增出1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶基因yqhD,经测序确认,将yqhD基因与四环素抗性基因TetR同时插入表达载体pUC18构建重组质粒pUC18-yqhD-TetR,重组质粒转化Klebsiella pneumoniae ME308;37℃,经1.0mmol/LIPTG诱导8h,重组肺炎克雷伯氏菌中1,3-丙二醇氧化还原酶同功酶的酶活力达到4.16U/mg,而对照菌株的酶活仅为0.62U/mg;将重组菌在摇瓶中进行微氧发酵培养,经IPTG诱导,可将60g/L甘油转化为33.8g/L1,3-丙二醇。     

利用木糖高产谷胱甘肽酵母菌株的诱变选育及培养条件优化

以CT1463(热带假丝酵母)为出发菌株,经紫外诱变结合镉盐平板筛选,获得-株高产谷胱甘肽的突变株CV26,其谷胱甘肽产量和舍量分别为45.4mg/L和7.05mg/g,较出发菌株提高了41%和52%.对CV26发酵条件进行了优化,在优化发酵条件下谷胱甘肽产量和含量分别为128.70 mg/L和14.31 mg/g,分...     

红曲霉9901液态发酵产莫纳可林K的发酵条件

对红曲霉 990 1产莫纳可林K的液态发酵培养基的组成和发酵条件进行了研究 ,确定出以甘油为碳源 ,大豆水解液为氮源 ,C/N比为 1 0 /1的最佳培养基组成 ,得出 990 1液态法产莫纳可林K的最适 pH为 4 5 ,温度 2 6℃ ,接种量为 5 %(体积分数 ) ,发酵时间 1 4d。通过实验 ,摇瓶发酵的莫纳可林K含量可以达到 1 60 0mg/L ,在 1 5L小型发酵罐实验中 ,莫纳可林K含量可达到888 9mg/L。     

补料分批发酵生产谷胱甘肽的研究

考察5L 发酵罐中分批补加葡萄糖对发酵生产谷胱甘肽(GSH)的影响。采用20g/L 初糖质量浓度,在发酵12h 至27h 每隔3h 分别补加22、24、24、24、24g/L 和22g/L 葡萄糖,可以使酿酒酵母在发酵33h 时GSH 质量浓度达到72.49mg/L,细胞干质量浓度达到28.52g/L,分别为初糖20g/L 分批培养方式的2.86 倍和4.93 倍。补料分批发酵可以明显促进酿酒酵母生长和提高GSH 的合成。