高温大曲中产吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵产物分析

该试验从高温大曲中筛选产吡嗪芽孢杆菌（Bacillus）,通过形态观察及磷脂脂肪酸（PLFA）分析对其进行鉴定,并采用发酵试验分析其代谢产物。共筛选出3株芽孢杆菌,即菌株B1、B2、B3。经分析鉴定后得出：菌株B1为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）;菌株B2和B3为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）。3株菌发酵产物分析结果表明,在液态发酵条件下3株菌发酵产吡嗪,其中菌株B2和B3发酵产物中吡嗪相对含量较高,均＞60%;固态发酵条件下生成吡嗪前体物质3-羟基-2-丁酮,且发酵产物中相对含量均＞75%。表明这3株芽孢杆菌对酱香型白酒风味物质的产生有着一定的影响。     

高温大曲中产四甲基吡嗪细菌的筛选及鉴定

四甲基吡嗪是中国白酒中的重要香气化合物。该研究从高温大曲中分离纯化获得26株菌株,通过V-P实验初筛,其中10株为四甲基吡嗪前体物3-羟基丁酮高产菌株。进一步通过液态发酵复筛,结合气相-质谱联用（GC-MS）仪分析测定,最终筛选出2株高产四甲基吡嗪的菌株A7和A18,其四甲基吡嗪产量分别为350.98 mg/L、163.49 mg/L。根据菌落形态特征和16S rRNA序列分析,菌株A7和A18分别被鉴定为甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）和蛋白水解芽孢杆菌（Bacillus proteolyticus）。菌株A7发酵产物GC-MS结果显示,吡嗪类化合物相对含量最高,达到了47.05%,其中以四甲基吡嗪为主,相对含量为45.30%。菌株A7和A18均可应用于白酒酿造工艺改进,提升原酒中四甲基吡嗪的含量,增加白酒保健功能。     

高温大曲中大曲岩石芽孢杆菌的筛选及其特性分析

该研究以不同高温大曲样品为研究对象,采用顶空固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)及高通量测序技术探究火山渣芽孢杆菌属(Scopulibacillus)与大曲风味的关联程度。结果表明：随大曲颜色的加深,Scopulibacillus丰度明显增多,Scopulibacillus与6种风味化合物呈显著正相关。从黑曲中分离得到一株纯种大曲岩石芽孢杆菌Scopulibacillus daqui LBM32026,分析菌株在不同温度下的生长特性和风味代谢情况。发现其在50℃和60℃条件下生长较为迅速,在30℃和40℃条件下生长速度变慢甚至出现抑制生长的现象。在单菌固态发酵中共检测出挥发性化合物40种,包括8种醇类、2种酯类、3种酸类、8种含氮类、7种芳香族、4种酚类、5种醛类、1种酮类、1种内酯类和1种其他类化合物。该研究有助于高温大曲中嗜热微生物的研究,并为其日后在制曲工艺中的生产应用提供理论依据。     

高温大曲中高产四甲基吡嗪芽孢杆菌的分离鉴定及发酵条件优化

该研究从高温大曲中分离筛选产四甲基吡嗪（TTMP）芽孢杆菌,采用细胞形态学观察、生理生化试验及分子生物学技术对高产四甲基吡嗪菌株进行鉴定,并优化四甲基吡嗪产量最高菌株的发酵条件。结果表明,经初筛从高温大曲中分离出20株产四甲基吡嗪芽孢杆菌（编号为WH1～WH20）,经过复筛得到四甲基吡嗪产量较高的菌株WH7、WH10和WH20。其中菌株WH7和WH20被鉴定为副淀粉芽孢杆菌（Bacillus paramycoides）,菌株WH10被鉴定贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。菌株WH10的最佳发酵条件为：前发酵温度37℃、前发酵时间72 h,后发酵温度60℃,后发酵时间20 h,初始pH值6.5,铵盐添加量4 g/L。在此优化条件下,四甲基吡嗪产量为728.38 mg/L,比优化前提高了167%。     

偏高温大曲发酵过程中芽孢杆菌的演替

采用经典微生物学方法和16S rRNA基因系统发育分析的方法,对偏高温大曲发酵过程中的芽孢杆菌类群及其演替情况进行了分析。结果表明,在偏高温大曲发酵过程中,芽孢杆菌数量从拌料的6.0×105个/g曲快速上升到最大值3.2×107个/g曲（第一次翻曲,4 d）,最后降低到1.1×106个/g曲;芽孢杆菌类群从最初的3种增加到10种后减少至第一次翻曲时（4 d）的9种,随后多样性持续下降,到收曲时仅检测到6种。同时发现,在整个发酵过程中Bacillus licheniformis为绝对优势种,在整个发酵环节中均存在。Bacillus产芽孢的特性保证了其种群的延续性。     

中高温大曲中芽孢杆菌多样性及代谢特征研究

为探究大曲中芽孢杆菌的代谢特征和功能性,首先采用传统培养法结合分子生物学技术从中高温大曲中分离、鉴定芽孢杆菌,对其微生物多样性进行分析;然后通过耐受性分析从中筛选优势菌,最后利用代谢组学方法分析其代谢特性。结果表明,共分离、鉴定得到49株芽孢杆菌,其中3株芽孢杆菌耐受性较好,分别为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）BA-5、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BS-7和贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BV-10。从单菌株及混合菌株发酵后的发酵液中共检测到23种挥发性代谢物和52种非挥发性代谢物,其中,愈创木酚以菌株BS-7单独培养时含量最高,为8.56 mg/L。同时芽孢杆菌混合发酵会增加4-乙烯基愈创木酚的生成量,在菌株BV-10和BA-5混合培养后,达到104.47 mg/L,说明芽孢杆菌单菌株及种间协同作用对白酒酿造中的特征物质形成具有重要影响。     

高温大曲中产耐热性蛋白酶芽孢杆菌的筛选和鉴定

从高温大曲样品中通过分离纯化,在牛奶琼脂平板上初筛得到产耐热性蛋白酶的菌株,然后液体发酵培养测定蛋白酶酶活挑选出产酶较强的菌株A1。在经过菌株形态特征、生化鉴定、16SrDNA分子生物学鉴定为芽孢杆菌属苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。选择三个主要影响因子葡萄糖、酵母浸出粉和pH,运用响应面法优化发酵培养基,最佳产酶培养基为pH为8.4,葡萄糖添加量为1.092%,酵母浸出粉添加量为0.902%,最佳酶活力为142.81u/mL。测定蛋白酶酶作用的最适温度是61℃,且在55～70℃之间有较高的酶活力,60℃相对酶活为97.63%。      

酱香型高温大曲中高产蛋白酶细菌的分离及鉴定

用检测蛋白酶透明圈和蛋白酶活性测定相结合的方法,从酱香型高温大曲中筛选出1株高产蛋白酶细菌,并通过生理生化特征实验及16S r DNA序列同源性分析,鉴定该高产蛋白酶菌株为解淀粉芽孢杆菌。     

大曲中产酱香芽孢杆菌的筛选及其代谢产香探析

对茅台酒生产各环节所采集的28个样品进行了初步分析,从高温大曲制作过程的不同环节筛选出芽孢杆菌104株,用麦曲模仿升温发酵筛选产香的菌株,经鉴定分别为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等,其中产酱香优良的菌株25株,分为多种香味,与不产香型的细菌对比,产酱香的25株均能产生二乙酰、乙偶姻、蛋白酶、淀粉酶等,结合茅台的生产流程分析了其产香的可能机制,得到结论：芽孢杆菌在大曲发酵过程中产生蛋白酶和淀粉酶等多种酶类和代谢物质,进而在高温、偏酸环境下通过美拉德反应产生吡嗪等多种茅台酒特征香味物质。     

酱香大曲中高产蛋白酶功能细菌的筛选及鉴定

通过对酱香型大曲中的细菌进行分离纯化培养,获得一株高产蛋白酶的菌株FBKL1.0199,然后采用菌株形态学观察、生理生化实验和分子生物学方法,鉴定其为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。实验条件下该菌株所产中性蛋白酶高达3 925.80 U/g,酸性蛋白酶活力达139.27 U/g,为提高酱香型白酒品质研究奠定了基础。     

中高温大曲中产酯酶细菌的筛选

通过在培养基中添加底物三丁酸甘油酯,从中、高温大曲中初步筛选到产酯酶细菌15株.以乙酸对硝基苯酯为底物,其中12#菌株表现出最高催化活力其酶活为0.83U/mL;以乙醇、己酸为底物,其中10#菌株表现出最高催化活力其酶活为6.7U/mL.对上述两种测定方法中相对酶活较高的菌株恒温振荡培养(36℃、150r/min) 72h后取其发酵液离心(12000r/min,4℃)20min进行气相色谱分析,结果表明这些菌株都能产生一定量的酸类、醇类和酯类物质.     

中高温大曲中的挥发性成分分析

采用索氏提取法对浓香型中高温大曲中的挥发性成分进行提取,并应用气质联用技术对提取物进行定性分析研究.结果表明,从大曲中共检测出主要成分39种,其中含氮化合物8种、醇类化合物7种、有机酸类化合物10种、酚类化合物4种、酯类化合物2种、含氧杂环类化合物3种、烷烃类化合物2种、芳香族化合物1种、酮类化合物2种.其中,四甲基吡嗪、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚和苯乙醇对大曲的香气有重要贡献.     

高温大曲中一株酱香功能菌的分离鉴定及验证

从不同类型的高温大曲中筛选出31株芽孢杆菌,通过对各菌株的理化特性及产香实验,认定1株菌为产酱香的功能菌。经生理生化及其分子生物学鉴定为腊样芽孢杆菌。     

不同等级高温大曲微生物群落和代谢物的特征分析

该研究采用高通量测序（HTS）、气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）和氢谱核磁共振（1H NMR）比较了不同等级高温大曲微生物群落和代谢物的差异。HTS结果表明,不同等级高温大曲基于属水平的优势菌群有一定差异,一级大曲中优势菌属为慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）、克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和曲霉属（Aspergillus）等,优级大曲中优势菌属为芽孢杆菌属（Bacillus）、克罗彭斯特菌属和踝节菌属（Rasamsonia）等,特级大曲中优势菌属为芽孢杆菌属、克罗彭斯特菌属和曲霉属等。GC-IMS结果表明,不同等级高温大曲挥发性代谢物组成及含量的差异主要体现在醇类、醛酮类和酯类等物质。1H NMR检测结果表明,不同等级高温大曲中非挥发性代谢物组成及含量的差异主要体现在氨基酸等物质,且特级大曲非挥发性代谢物的种类更为丰富、含量更高。     

基于酶学特性筛选大曲来源芽孢杆菌用于强化酿酒

通过分析来源于清香型、浓香型和酱香型大曲的105株芽孢杆菌的产淀粉酶和蛋白酶的能力,优选出1株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)B.L-1和1株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B.S-1,将其分别应用于清香型白酒酿造中,探究强化接种微生物对发酵的影响.发酵结束后,在酒醅中共检测到挥发性代谢...