天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达

根据NCBI中的黑曲霉天门冬酰胺酶基因asp序列(GI:145231287)设计特异性引物,从黑曲霉CICC2462基因组中扩增asp基因编码区,构建其黑曲霉表达载体p SZHG-Asp。通过农杆菌介导法转化黑曲霉,筛选以asp基因置换糖化酶基因gla A的同源重组转化子。对转化子的表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活检测。获得8株在gla A位点发生基因置换的同源重组转化子,并对其中4株的上清液进行检测。SDS-PAGE结果显示,在42 000处有目的蛋白质条带,重组菌株的目的蛋白质表达量为185~417μg/m L,发酵液最高酶活为21 111 U/m L。     

两株丝状真菌联合转化生产香草醛的研究

本文对黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC0774和朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)CGMCC1115联合转化来源于米糠油脚的阿魏酸生产香草醛进行研究。通过60Co诱变黑曲霉菌株,得到耐较高底物浓度且不降解产物的突变株产香草酸2.48g/L;其转化液经过滤,调pH至5.0,补加5g/L葡萄糖,灭菌处理后,作为朱红密孔菌离菌体转化的底物溶液进行转化,得到1.07g/L香草醛。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。     

农杆菌介导转化黑曲霉条件优化及脂肪酶表达

优化了农杆菌介导转化黑曲霉的方法,优化条件包括共培养材料、农杆菌种类、诱导剂浓度、共培养时间、共培养温度以及共培养时农杆菌的菌体浓度。结果表明,农杆菌介导转化黑曲霉的最适条件为107个/mL不萌发的新鲜孢子与OD_(600)培养至0.9～1.0的农杆菌以1∶1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol/L的IM平板上,23℃避光培养48 h后进行转膜,转化子个数可达到(60±5)个转化子/10~6个孢子,且阳性率达到90%以上。并且构建了同源黑曲霉脂肪酶的组成型和诱导型启动子表达载体,通过优化后的农杆菌介导转化方法转化至黑曲霉中,利用罗丹明橄榄油平板对产酶转化子进行筛选鉴定,并获得了阳性克隆。     

冬小麦膨胀素基因EXPB7工程菌构建及纤维素水解作用分析

为了寻找促进纤维素降解的有效方法来提高纤维素酶的降解效率。本研究以东农冬麦1号膨胀素基因EXPB7为供体,构建黑曲霉表达载体,以黑曲霉CICC2462为受体,采用农杆菌介导法遗传转化黑曲霉,构建膨胀素基因黑曲霉工程菌pSZHGS-EXPB7,并对该工程菌发酵液的纤维素水解促进作用进行分析。结果表明,黑曲霉重组膨胀素蛋白在对滤纸处理2 d后崩解效果明显,与出发菌株的分泌蛋白相比,具有一定的促进作用;重组菌株发酵液上清处理滤纸产生的还原糖含量显著高于出发菌株(P<0.05),与仅用酶液处理滤纸相比,能够将纤维素酶的水解效率提高32.9%。     

多聚半乳糖醛酸酶在黑曲霉中的超量表达及其酶学性质研究

运用基因工程手段,构建高效表达多聚半乳糖醛酸酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期更好的实现多聚半乳糖醛酸酶在食品加工、饲料生产及废水处理中的重要作用。从果胶酶生产菌黑曲霉GJ-1中扩增得到多聚半乳糖醛酸酶基因pgaB的成熟肽编码序列(1232 bp),集成glaA多拷贝强启动子和信号肽,构建其黑曲霉表达载体pSZHG6RS-pgaB,通过农杆菌介导法转化黑曲霉,获得多聚半乳糖醛酸酶黑曲霉重组菌株。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为38 kDa;在发酵第10 d时酶活最高达到4617.8 U·mL-1。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为5.0,碱性耐受能力较强;Ca2+、Fe3+、Fe2+均对重组酶有一定激活作用;重组酶对不同底物的催化能力不同,甲酯化程度越高酶对其降解能力越弱,其中对无甲酯化的多聚半乳糖醛酸催化能力最强,DE值为33.04%。重组菌株产酶活性较高,具有明确的产业化前景。     

阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达

利用食品级黑曲霉表达系统同源表达阿魏酸酯酶是提高阿魏酸酯酶产量、降低生产成本的有效途径。利用PCR技术扩增黑曲霉阿魏酸酯酶A基因(faeA)的编码区,构建黑曲霉表达载体pSZHG-faeA,并通过农杆菌介导法转化黑曲霉。经筛选获得将faeA基因整合到糖化酶基因位点的同源重组转化子4株。在酶摇瓶发酵条件下,重组菌株培养液上清中的阿魏酸酯酶活性最高达18.6mU/mL。SDS-PAGE分析显示,4株重组菌株都有约36ku目的蛋白条带,表达量为188~262μg/mL。结果表明,实现了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达,为食品级阿魏酸酯酶的大规模工业化生产奠定了基础。     

黑曲霉高效敲除体系构建及tpsA基因的敲除

为完善高效的黑曲霉工程菌10142基因敲除体系,提高其基因敲除效率,构建含有致死基因单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSVtk)的基因敲除质粒,通过农杆菌介导的黑曲霉转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)法,使致死基因随机插入黑曲霉基因组,其阳性转化子在添加10μmol/L的5-氟脱氧尿苷的培养基上无法生长,从而得到致死基因随机插入转化子的"反向筛选"方法。利用该方法对黑曲霉海藻糖-6-磷酸合成酶进行基因敲除,结果表明阳性转子占总转化子的比例为63%。成功构建高效黑曲霉基因敲除体系。     

硫酸二乙酯与紫外线复合诱变选育糖化酶高产菌株的研究

目的通过诱变育种,提高糖化酶生产菌株黑曲霉WT(Aspergillus niger WT)的产酶能力。方法用硫酸二乙酯(DES)和紫外线(UV)进行复合诱变,通过淀粉透明圈法筛选优势菌株,并通过摇瓶发酵对优势菌株的产酶能力进行验证。结果通过DES诱变,得到一株产酶能力为11 737 U/ml的突变株DES3,较原始菌株黑曲霉WT产酶能力提高30%;将DES3进行紫外诱变,得到一株产酶能力为13 858 U/ml的突变株DUV1,产酶能力较DES3提高18%,较原始菌株黑曲霉WT提高53%。结论本论文采用DES和UV复合诱变的方法,有效提高了糖化酶生产菌株黑曲霉WT的产酶能力,对糖化酶产业的发展具有重要意义。     

黑曲霉TNA-09中α-葡萄糖苷酶基因敲除的研究

以柠檬酸生产菌黑曲霉TNA—09为原始菌株,通过农杆菌介导的方法,将其α-葡萄糖苷酶基因敲除,得到基因敲除菌株TGA101。对原始菌株黑曲霉TNA-09和基因敲除菌TGA101 α-葡萄糖苷酶活力测定,结果相对于TNA—09菌株,TGA101菌株α-葡萄糖苷酶活力下降61．15％。在柠檬酸发酵试验中表现出相对于黑曲霉TNA-09,TGA101菌株发酵液中异麦芽糖含量降低84．67％,柠檬酸提高2．34％,糖酸转化率提高2．34％。     

高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株

以黑曲霉为研究对象,建立了高通量筛选葡萄糖酸钙高产菌株流程。结果表明:紫外线-LiCl复合诱变处理的黑曲霉孢子悬浮液,高通量筛选得到4株高产菌株,传代后发酵性能稳定。菌株P-9,其发酵液葡萄糖酸钙含量达到23.04 g/100 mL,比原始菌种高5.86 g/100 mL。相较于传统摇瓶发酵筛选工作量大,周期长,该方法显著提高了筛选效率。     

一种中温淀粉酶在解淀粉芽孢杆菌LT的重组表达

解淀粉芽孢杆菌可用作多种食品工业酶的生产菌株,但其极低的转化效率影响了这类工业菌株的重组改造及优化。通过对1398解淀粉芽孢杆菌和一种地衣芽孢杆菌Jbac基因组的数据分析,发现这些微生物存在IV型DNA限制修饰系统。对这些微生物转化经甲基化和未经甲基化的质粒,证实外源DNA甲基化修饰会降低DNA的转化效率;利用将外源质粒进行相同类型甲基化的这种新转化策略,表达质粒pMK4E-dx被转入解淀粉芽孢杆菌LT中,发酵结果显示,其中重组菌株LT-J1/pMK4-dx和LT-J2/pMK4-dx分泌的中温淀粉酶活达到145.9和153.6 U/mL,分别为原菌株发酵淀粉酶活的3.65和3.84倍。     

多黏类芽孢杆菌JSa-9电转化方法的优化

为建立多黏类芽孢杆菌JSa-9菌株的高效电击转化体系,本实验研究菌体培养时间、电场强度、电击缓冲液、质粒用量以及电击后复苏培养时间等因素对JSa-9菌株电转化效率的影响。结果表明：Paenibacillus polymyxaJSa-9培养至OD595 nm为0.3时,电转化效率最高,为0.12×103 CFU/μg DNA;用0.5 mol/L甘露醇、0.5 mol/L山梨醇以及10%甘油的电击缓冲液洗涤细胞,在电场强度17.5 kV/cm、电阻200 Ω,电容25 μF的电击条件下,加入1.0 μg/100 mL质粒DNA,复苏培养时间18 h,电转化效率达到约为0.36×103 CFU/μg DNA;制备P. polymyxa JSa-9原生质体,在电场强度5.0 kV/cm的电击条件下,加入0.8 μg/100 mL质粒DNA,电转化效率较感受态电转提高到约1.0×103 CFU/μg DNA。     

Convenient transformation of anamorphic basidiomycetous yeasts belonging to genus pseudozyma induced by electroporation

A convenient procedure for carrying out transformation by electroporation was optimized for the genus Pseudozyma. Successful transformation was achieved using a plasmid, pUXV1, that confers resistance to hygromycin B; the maximum transformation efficiency was 48 transformants/mug of plasmid DNA. Transformants of Pseudozyma antarctica T-34 expressing a green fluorescent protein were obtained by the procedure.     

采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体的构建

为在泡盛曲霉中表达外源基因、克服泡盛曲霉常规转化法效率低下的瓶颈,本研究拟构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体。通过PCR,从糖化酶基因(glaA)高效表达的泡盛曲霉菌株SG1 基因组DNA 扩增获得glaA 2.1 kb 启动子片段(包含信号肽编码序列)及1.1kb 终止子片段,构建了外源基因表达盒。以根瘤农杆菌双元载体pCAMBIA1302 为基础,删除非必需区段及多余限制酶位点,插入上述外源基因表达盒及来自丝状真菌标记载体pAN7-1 的潮霉素抗性标记,构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉分泌整合型表达载体pSUAA52am。转化结果表明：采用原生质体法的转化效率为21 个转化子/106 分生孢子,而农杆菌介导法可达1106 个转化子/106 分生孢子,是原生质体法的53 倍。构建载体成功利用glaA 表达盒与农杆菌介导转化法的高效特性,可为利用泡盛曲霉高效表达外源基因奠定基础。     

高产柠檬酸的SHAM特性黑曲霉突变株的选育

研究了SHAM (水杨酸氧肟酸 )对产酸的影响。 5mg/ 6 0mL的SHAM基本抑制柠檬酸的产生。当W 3菌株在加有 10mg/ 10mLSHAM(L1)的平板上生长时 ,只能着生 10 %的孢子 ,在加有 2 0mg/ 10mLSHAM (L2 )的平板上生长时不能着生孢子。据此选育出不能够在L1平板上着生孢子的SHAM敏感株和在L2平板上能够着生孢子的SHAM抗性株。通过发酵试验 ,SHAMS- 2菌株产柠檬酸比出发菌株W 3高 4 0 % ,转化率达到 91 7%     

亮氨酸氨肽酶LapA在无孢黑曲霉中的重组表达优化及酶学性质

针对目前国产食品级亮氨酸氨肽酶的工业生产产量不高的现状,将米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉的5 个亮氨酸氨肽酶基因（lapA、lap1O、lap2、lap1S、lap1N）在低蛋白背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达,通过信号肽替换对其编码区进行改造,利用杂合启动子PnaII及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,并基于规律间隔成簇短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/Cas9工具设计亮氨酸氨肽酶的基因组定点整合策略,获得高活力的亮氨酸氨肽酶表达菌株,重组菌株LapA-C的亮氨酸氨肽酶活力达到11 701.2 U/mL,比未利用CRISPR工具的LapA-T重组表达菌株的酶活力（2 476.0 U/mL）提高了约3.7 倍。此外,通过融合6×His标签实现了重组亮氨酸氨肽酶LapA的纯化,并对其进行了酶学性质研究：蛋白质大小约为35.0 kDa,重组亮氨酸氨肽酶LapA最适pH值为8.5,最适温度为65 ℃。综上所述,本研究基于CRISPR策略成功实现了亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的高效重组表达。     

纳他霉素高产菌株的选育及其发酵条件的研究

利用链霉素抗性突变选育纳他霉素高产菌株 ,即将经过紫外线诱变处理的纳他霉素(natamycin)产生菌褐黄孢链霉菌 (Streptomycesgilvosporeus)ATCC1 332 6菌株孢子涂布在含有链霉素最小抑制浓度 (0 6μg/mL)的培养基平板上 ,获得了 1 2 2株链霉素抗性突变株。其中纳他霉素产量高于出发菌株的有 1 3株。其中突变株SG 56的生产能力比出发菌株提高到 1 4 6 % ,研究了其发酵性能 ,优化了培养基组成和发酵工艺条件 ,使纳他霉素产量提高到 1 70 %。     

绿色木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究

为提高绿色木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的能力,进行了黑曲霉接种时间和混合发酵时间的优化。研究了绿色木霉与黑曲霉4株菌单独发酵及混合发酵产纤维素酶酶活的特点,调整黑曲霉NH11-1的接种时间与绿色木霉NM01进行混合发酵来寻找产酶能力最高的时间点。结果表明,黑曲霉NH11-1推迟48 h接种的混合发酵组产酶效果最佳。最佳混合发酵条件为30 ℃、200 r/min恒温振荡培养5 d,滤纸酶活力（FPA）达到242.80 U/mL,是出发菌黑曲霉NH11-1的2.66倍;β-葡萄糖苷酶活力（β-GA）达到297.35 U/mL,是出发菌绿色木霉NM01的1.94倍;β-GA与FPA的比值为1.22,符合纤维素酶水解天然纤维素的最佳比值范围（0.12～1.50）。     

柚苷酶产生菌的分离筛选及鉴定

利用柚苷酶平板透明圈筛选方法,加大透明层与未分解层的颜色对比,提高菌种筛选的效率,改进柚苷酶产生菌的选育模型。筛选出1株柚苷酶生产菌株A13。对该菌株进行摇瓶发酵,测定酶活力达到365.31U/mL。通过对该菌株形态特征、培养特征的观察,对照《真菌鉴定手册》,初步判定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)。