嗜热脂肪芽孢杆菌产β-半乳糖苷酶发酵条件优化

研究了嗜热脂肪芽孢杆菌C953产β-半乳糖苷酶的发酵条件。研究得出C953产酶适宜培养基为:牛肉膏、大豆蛋白胨、NaCl、K2HPO4、KH2PO4;产酶的适宜发酵条件为:培养温度50℃,接种量10%,1000mL三角瓶的装液量200mL,初始pH7.0,摇床转速220r/min,培养时间24h。发酵液中β-半乳糖苷酶酶活力可达4.39NLU/mL。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定表明,β-半乳糖苷酶由分子质量为104.9kDa和114.3kDa的亚基组成。      

嗜热脂肪芽孢杆菌耐热β-半乳糖苷酶功能位点的累积进化研究

针对嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源耐热β-半乳糖苷酶Bga B底物结合位点构建突变体,研究底物结合位点累积突变的功能进化及水解活性的变化规律。实验结果表明:Y272A与E351R的累积突变体比酶活为野生型酶的3.67倍,为单点突变体Y272A的2倍;Y272A/E351R突变体的Km值增大,其对乳糖的亲和力下降,但由于Kcat值增大,使累积突变体Y272A/E351R催化效率提高为野生型酶催化效率的7.8倍。本研究结果表明底物结合位点间的累积突变可改变底物亲和性,并对水解催化活性进化起到正向促进作用。     

嗜热脂肪芽孢杆菌耐热β-半乳糖苷酶功能位点的累积进化研究

针对嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）来源耐热β-半乳糖苷酶Bga B底物结合位点构建突变体,研究底物结合位点累积突变的功能进化及水解活性的变化规律。实验结果表明:Y272A与E351R的累积突变体比酶活为野生型酶的3.67倍,为单点突变体Y272A的2倍;Y272A/E351R突变体的Km值增大,其对乳糖的亲和力下降,但由于Kcat值增大,使累积突变体Y272A/E351R催化效率提高为野生型酶催化效率的7.8倍。本研究结果表明底物结合位点间的累积突变可改变底物亲和性,并对水解催化活性进化起到正向促进作用。      

嗜酸乳杆菌产β-半乳糖苷酶发酵条件的优化

采用Plackett-Burman试验设计从影响Lactobacillus acidophilus CICC6075产β-半乳糖苷酶的15个因素中筛选出3个显著因素,然后通过响应面分析法优化最佳发酵工艺参数,测定其在最适产酶条件下的酶活力。结果表明：影响嗜酸乳杆菌产酶的显著因素为发酵温度、酵母粉质量浓度和柠檬酸三胺质量浓度,其最佳工艺条件分别为36℃、6.22g/L、2.35g/L。在此条件下最高酶活力的预测值为3.95U/L,与实测值(3.98U/L)十分接近。本实验利用优化工艺发酵产酶,酶活力提高了近两倍。     

嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB转糖苷催化活性改造

该研究以GH42家族嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB为研究对象,针对其转糖苷活性弱的问题,采用定点突变与化学修饰相结合的方法,对其预测亲核催化位点Glu303进行了功能研究与分子改造。所得突变体Ox-E303C与野生型酶相比,可将低聚半乳糖合成量由0%提高到11. 5%。研究结果表明对耐热β-半乳糖苷酶BgaB亲核催化位点进行半胱氨酸亚磺酸(—SOO-)替换,能够提高其转糖苷催化活性。该研究对GH42家族β-半乳糖苷酶转糖苷催化功能的分子改造具有广泛的参考价值。     

产β-半乳糖苷酶酵母菌株15D产酶条件研究

从马克斯克鲁维酵母的突变菌株中,获得了一株高产β-半乳糖苷酶的酵母菌株15D。本文对菌株15D的产酶条件及小型发酵培养实验进行研究,表明在适宜条件下菌株15D产酶水平可达287.8U/mL,比出发菌产酶水平提高了5倍。      

耐高温β-半乳糖苷酶菌株筛选及酶特性研究

采用乳糖作为单一碳源、X-gal做显色剂,从奶牛场土壤中筛选到90株产β-半乳糖苷酶的菌株。根据菌落在初筛平板上菌落蓝色深浅和蓝色圈直径,复筛出10株酶活较高的菌株。以ONPG为底物,测定该10株菌发酵液β-半乳糖苷酶的水解活性及稳定性,复筛出1株革兰阳性好氧细菌,命名为菌株XG24。通过形态学、生理生化实验以及菌株16SrDNA序列分析,菌株XG24鉴定为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。所产酶最适反应温度和pH分别为65℃和6.5℃;该酶在实验所用温度40~75℃内酶活性稳定,70℃孵育1h,残留酶活仍有80%;在pH4.0~8.0之间酶活相对稳定。浓度为1mmol/L的Mg2+、Fe2+、Co2+以及Mn2+离子对酶有强烈的激活作用,但Hg2+、Cu2+及Ag+抑制酶活性。酶活还受到高浓度的乳糖水解产物葡萄糖和半乳糖一定的反馈抑制作用,其他糖对酶活性没有明显影响。这些酶的优良生化特性赋予了该酶在乳品工业中具有重要的应用价值。     

嗜热芽孢杆菌2004产β-甘露聚糖酶产酶条件优化和酶学性质

对芽孢杆菌2004 β-甘露聚糖酶进行了产酶条件优化、初步纯化及其酶学性质的研究.条件优化结果:1.5 g/dL槐豆胶,2 g/dL蛋白胨,培养温度为40 ℃,250 mL三角瓶装液量为70 mL,其他因素影响不大.此最佳产酶条件下,嗜热芽孢杆菌2004 12 h的产酶水平平均为41.92 U/mL,比原来提高了30倍.培养液离心得到上清液,经硫酸铵沉淀,Sephadex G-200分子凝胶过滤和DEAE纤维素离子交换,酶比活达到722 U/mg,纯化了23.94倍,收率为35.1 %.该酶的最适反应温度为70～80 ℃;反应的最适pH值为5.8～6.0;pH值稳定范围为4.0～9.0.金属离子Mg2 和K 对酶略有激活作用.适当浓度的Mg2 不仅对酶有激活作用,还对酶的热失活具有保护作用.     

产耐热β-半乳糖苷酶蜜源芽孢杆菌的鉴定及酶学性质

从分离自蜂蜜的芽孢杆菌中筛选到一株高产β-半乳糖苷酶的菌株,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),并命名为Bacillus licheniformis SYBC hb15。纯化该酶并研究其酶学性质,以邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,B. licheniformis SYBC hb15所产β-半乳糖苷酶的最适水解反应温度是60℃;70℃放置60 min后酶活力仍保留65%,具有较高的热稳定性;与嗜热菌Talaromyces thermophilus来源的β-半乳糖苷酶相比,葡萄糖对其水解活性的抑制较弱。因此,B. licheniformis SYBC hb15所产的β-半乳糖苷酶具有较高的热稳定性和葡萄糖耐受性,有很好的工业应用潜力。     

响应面法优化植物乳杆菌产β-半乳糖苷酶发酵培养基

采用单因素试验分析不同碳源、氮源对植物乳杆菌KLDS1.0628产β-半乳糖苷酶的影响,在此基础上利用Plackett-Burman,Box-Behnken实验设计对发酵培养基成分含量进行优化。结果表明,Plackett-Burman设计筛选出3个主要因素为乳糖、乙酸钠、柠檬酸氢二铵,其最佳质量浓度分别为16.41,10.21,5.83 g/L。在优化后的培养基下,β-半乳糖苷酶活可达3.32 U/m L,与理论预测值3.40 U/m L基本一致,酶活比优化前提高了73.8%。     

耐热β-半乳糖苷酶基因bgaB在枯草芽孢杆菌中的整合表达

来源于嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstearothermophilus的耐热β 半乳糖苷酶基因bgaB被克隆到大肠杆菌-枯草芽胞杆菌穿梭质粒pMA5中,然后将外源基因及其表达调控序列亚克隆到枯草芽胞杆菌整合载体pSAS144中,转化Bacillussubtilis受体菌BD170,在5μg/mL的氯霉素抗性平板上筛选抗性转化子.经摇瓶发酵后,得到耐热乳糖酶的比酶活为0.32U/mg,是出发菌株比酶活的2倍.     

产β-半乳糖苷酶的节杆菌诱变选育及培养基优化

酶法合成乳果糖需要使用同时具备水解和转苷活力的β-半乳糖苷酶为催化剂。采用物理诱变,培养基优化手段,以提高细菌产该类β-半乳糖苷酶的能力为目的,自然筛选获得的具有转苷能力的节杆菌Arthrobacter sp.,经紫外线照射处理,采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)为平板筛选显色剂,加之摇瓶发酵筛选,得到8株产酶水平明显提高的诱变株,其中Arthrobacter sp.M2酶活力较野生株提高了89%,传代5次酶活基本稳定。采用正交实验优化产酶培养基,结果表明:在乳糖浓度为10g/L,玉米浆浓度为22g/L,Fe3+浓度为1.5mmol/L时效果最佳,酶活水平进一步提高了113%。紫外诱变和培养基优化有效地提高了节杆菌产β-半乳糖苷酶的水平。     

产β-半乳糖苷酶的节杆菌诱变选育及培养基优化

酶法合成乳果糖需要使用同时具备水解和转苷活力的β-半乳糖苷酶为催化剂。采用物理诱变,培养基优化手段,以提高细菌产该类β-半乳糖苷酶的能力为目的,自然筛选获得的具有转苷能力的节杆菌Arthrobacter sp.,经紫外线照射处理,采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）为平板筛选显色剂,加之摇瓶发酵筛选,得到8株产酶水平明显提高的诱变株,其中Arthrobacter sp.M2酶活力较野生株提高了89%,传代5次酶活基本稳定。采用正交实验优化产酶培养基,结果表明:在乳糖浓度为10g/L,玉米浆浓度为22g/L,Fe3+浓度为1.5mmol/L时效果最佳,酶活水平进一步提高了113%。紫外诱变和培养基优化有效地提高了节杆菌产β-半乳糖苷酶的水平。      

超声波细胞破碎法检测嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶活力的研究

采用超声波破碎法对嗜酸乳杆菌A和B产生的β-半乳糖苷酶进行提取,并以邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物测定了β-半乳糖苷酶的活力。通过单因素试验和正交试验,选出了超声波破碎的最佳工艺条件。实验表明,嗜酸乳杆菌A在工作时间7.6min,工作/间歇为28s/20s,温度36℃时,超声波对细胞的破碎效果较好,此条件下破碎后,A株产生的β-半乳糖苷酶活力为5.963μmolONP/L·min。嗜酸乳杆菌B在工作时间6.8min,工作/间歇为20s/20s,温度37℃时效果较好,产生的β-半乳糖苷酶活力为6.683μmolONP/L·min。因此,嗜酸乳杆菌具有较高产生β-半乳糖苷酶的能力。     

凝结芽孢杆菌RY237 β-半乳糖苷酶酶学性质研究

为研究乳品中具有应用价值的乳糖酶,以乳糖为唯一碳源,用邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）法,从产乳酸的细菌中筛选出了产乳糖酶活力高的菌株RY237,其活性达4.98 U/m L,鉴定为凝结芽孢杆菌。研究了乳糖酶的酶学性质,该酶最适反应温度和最适p H分别为50℃和6.0。该酶在温度40⁵0℃具有良好的稳定性;p H5.5⁸.0表现稳定,p H7.0出现酶活峰值。金属离子Ca²⁺、K+、Zn²⁺、Mn²⁺、Na+、Mg²⁺对酶活具有抑制作用,Cu²⁺对酶活具有完全抑制作用,EDTA对酶活具有激活作用。凝结芽孢杆菌RY237乳糖酶活性高、性能优良,具有应用价值。      

黑曲霉产α-半乳糖苷酶发酵条件研究

对从黄酒麦曲中筛选得到的黑曲霉wx-07产α-半乳糖苷酶的发酵条件进行了研究。结果表明,蔗糖是产酶的最适碳源,胰蛋白胨是最适氮源,产酶的最佳发酵条件为在250mL三角瓶中装入75mL培养基,接种量约为106个/750mL孢子,30℃、150r/min振荡培养96h,α-半乳糖苷酶活力达到2.40U/mL,是优化前的约3.08倍。     

嗜酸乳杆菌产生β-半乳糖苷酶活力的测定及数学模型的建立

以MRS为培养摹，对L．acidophilus Ind-1和L．acidophilus Lakcid两菌株产生β—半乳糖苷酶的活力进行了研究。结果表明，采用1％SDS：氯仿=1：10细胞破壁β—半乳糖苷酶的提取率较高，37℃ 36h培养，L．acidophilus Ind-2和Lacidophilus Lakcid可以产生2．229μ moleONP／L．min和1．808μ moleONP／L．min的β—半乳糖苷酶，且该酶在MRS培养基中积累的数学模型为Logistic和Mistcherlich方程。     

重组β-半乳糖苷酶的制备及转化条件优化

以前期构建的产Bacilluscirculansβ-半乳糖苷酶重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b-lac为菌种,进行摇瓶发酵诱导培养,培养24 h胞外上清酶活达15 U/mL。利用制备的β-半乳糖苷酶粗酶液进行酶转化实验。优化了酶转化条件,考查了初始pH、反应温度、乳糖质量浓度、加酶量和反应时间等因素对低聚半乳糖产率的影响。确定最优转化条件为:初始pH 6.5、反应温度55℃,起始乳糖质量浓度为700 g/L,加酶量为8 U/mL。在此条件下反应16 h,低聚半乳糖转化率可达57%。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达

用PCR的方法从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilis ATCC8005)染色体DNA中扩增到耐热β- 半乳糖苷酶基因bgaB,装载到大肠-枯草穿梭质粒pZZ01中,并将其转化到枯草杆菌宿主WB600中进行表达。在1%的淀粉培养基上摇瓶培养,36h时酶活达到24U/mL,和大肠杆菌pET系统相当。同时产酶出现了2个增长时期,第1阶段在对数生长期,第2阶段在静止期,这和重叠启动子P43的性质是相吻合的。     

Bacillus circulans来源β-半乳糖苷酶在Bacillus subtilis中的表达、性质及发酵优化

低聚半乳糖(galactooligosaccharide, GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖,因其优良的益生功能以及在高温和低pH下较高的稳定性而被广泛应用于婴幼儿奶粉等食品中,其主要由β-半乳糖苷酶以乳糖为底物进行生产。为了将具有更高转化率的β-半乳糖苷酶应用于食品领域,该研究首次将Bacillus circulans来源的β-半乳糖苷酶β-Gal-Ⅱ在Bacillus subtilis中进行了异源表达,并对其酶学性质、GOS的制备进行了测定,同时为了降低其工业化应用成本,对重组菌在摇瓶及3-L罐的发酵条件进行了优化。结果表明,重组β-Gal-Ⅱ制备GOS的最适作用条件为50℃、pH 5.0,该条件下GOS转化率在8 h可达最高值60.32%;在摇瓶的发酵条件优化中,以安琪酵母粉和玉米浆干粉各7.5 g/L为复合氮源时,总酶活力最高,可达6.82 U/mL,是TB发酵的1.5倍,单一氮源发酵的2～2.5倍;在3-L罐上进行了33、37℃两个温度的发酵优化,37℃发酵产量优于33℃,最终总酶活力可达138.3 U/mL,是摇瓶发酵的20.3倍。该研究为GOS的工业化生产提供技术...