利用酒糟处理液作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA的发酵工艺优化

为降低发酵培养裂殖壶菌生产DHA的成本,以酱香型白酒酒糟为实验材料,将其简单预处理后作为裂殖壶菌发酵培养基氮源,首先分析了酒糟处理液与胰蛋白胨的游离氨基酸组成与含量,然后以生物量、油脂产量和DHA产量为指标,对酒糟处理液、胰蛋白胨、酵母提取物和牛肉膏作为氮源培养裂殖壶菌生产DHA进行了比较,优化了酒糟处理液作为氮源时的发酵工艺条件,并对发酵废液进行三次循环利用。结果表明：酒糟处理液可以作为满足裂殖壶菌生长的氮源;与酵母提取物、牛肉膏相比,酒糟处理液作为氮源有明显优势;利用酒糟处理液作为氮源的最佳发酵工艺条件为酒糟（含水量约10%）与水质量比1∶ 9、酒糟处理液添加量70%（与基础发酵培养基中水的置换比例）、初始pH 7.0、培养时间108 h,在此条件下裂殖壶菌生物量、油脂产量和DHA产量分别达到22.14、8.88 g/L和284 g/L;最佳条件下三次循环添加15.0%（与基础发酵培养基中水的置换比例）发酵废液于酒糟处理液培养基中,裂殖壶菌DHA产量分别为4.27、3.70 g/L和2.75 g/L。综上,利用酒糟处理液培养裂殖壶菌生产DHA是酒糟资源化利用的新方法。     

裂殖壶菌发酵生产DHA研究进展

DHA是一种重要的多不饱和脂肪酸,裂殖壶菌(Schizochytrium)因富含DHA成为当前国内外研究热点。本文介绍了Schizochytrium及其合成DHA的代谢机理,并对国内外Schizochytrium发酵生产DHA的水平、发酵底物、发酵工艺进行综述。基于目前发酵状况,提出了DHA发酵过程中存在的问题,并指出选育高产稳定菌株、对合成DHA代谢途径及关键酶进行研究、改进合适的生物反应器并进一步应用数学工具优化发酵工艺是今后的研究重点。      

裂殖壶菌发酵产DHA油脂的生产工艺优化

采用磷酸香草醛法实时监测裂殖壶菌发酵产DHA油脂的积累情况,对裂殖壶菌的基础发酵工艺进行了优化。得到裂殖壶菌生长和油脂积累的最佳培养基配方为:葡萄糖30 g/L,玉米浆粉6 g/L,蛋白胨4 g/L,硝酸钠3.6~3.9 g/L,海水晶15 g/L;在50 L的发酵罐中采用后期流加一定量的葡萄糖提高碳氮比来提高油脂积累外,通过流加3.0 g/L的大豆油来刺激菌体生长,最终经过72 h的流加培养,菌体湿重达到200 g/L,总油脂含量达到60%以上,油脂脂肪酸组成中的DHA含量占22%左右。     

裂殖壶菌产DHA发酵培养基的优化

从成本控制和发酵罐扩大培养监测控制方面考虑,优化了裂殖壶菌(Schizochytrium sp.FJU-512)产DHA发酵培养基。利用单因素实验和正交实验优化了发酵培养基碳氮源组分,均匀设计实验优化了无机盐组分。最佳产DHA发酵配方为葡萄糖120g/L,酵母浸膏5g/L,谷氨酸钠20g/L,硫酸铵0.25g/L,海水晶25g/L,KH2PO44.0g/L,Mg SO4·7H2O0.5g/L,Ca CO35.0g/L,Na2SO43.0g/L,Fe SO4·7H2O 20mg/L,维生素B10.005g/L,维生素B120.005g/L。优化后,裂殖壶菌DHA产量到达13.83g/L,提高了22%,且培养基成本降低40%左右。     

糖蜜发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸

对糖蜜作为碳源发酵裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸(docosahexaenic acid,DHA)进行了初步研究:选择不同来源的甘蔗糖蜜与粗糖蜜培养裂殖壶菌生产DHA,考察了糖蜜来源、糖蜜添加比例对裂殖壶菌发酵生物量、菌体油脂含量与DHA含量的影响。结果表明,甘蔗糖蜜中的杂质(灰分、胶体)对菌体生长与油脂积累存在明显的抑制作用,即使大幅降低糖蜜添加比例效果也不理想,限制了其作为替代碳源在实际生产上的应用。在此基础上考察了杂质含量相对较低的粗糖蜜的情况,在添加比例低于80%的情况下,其培养效果与对照葡萄糖非常接近,可以部分替代葡萄糖用于裂殖壶菌发酵生产。     

裂殖壶菌产DHA发酵培养基的优化

从成本控制和发酵罐扩大培养监测控制方面考虑,优化了裂殖壶菌（Schizochytrium sp.FJU-512）产DHA发酵培养基。利用单因素实验和正交实验优化了发酵培养基碳氮源组分,均匀设计实验优化了无机盐组分。最佳产DHA发酵配方为葡萄糖120g/L,酵母浸膏5g/L,谷氨酸钠20g/L,硫酸铵0.25g/L,海水晶25g/L,KH2PO44.0g/L,Mg SO4·7H2O0.5g/L,Ca CO35.0g/L,Na2SO43.0g/L,Fe SO4·7H2O 20mg/L,维生素B10.005g/L,维生素B120.005g/L。优化后,裂殖壶菌DHA产量到达13.83g/L,提高了22%,且培养基成本降低40%左右。      

裂殖壶菌补糖发酵研究

为了探索不同碳源浓度对裂殖壶菌(Schizochytrium)细胞营养生长和油脂积累的影响,对发酵调控进行研究,同时测定发酵液生物量、含油量、DHA含量和DHA产量。结果表明:发酵过程中通过补糖可以提高发酵液含油量和DHA产量,但糖浓度过高也会抑制发酵;当还原糖质量浓度调控在40 g/L左右时,生物量、含油量、DHA含量和DHA产量均达最高,分别为8.95 g/100 m L、22.42 g/L、41.71%、9.35 g/L,比对照组高出了76.18%、61.88%、4.3%、68.77%。     

不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响

研究不同碳氮源浓度和培养温度对裂殖壶菌产DHA的影响。用干重法测定裂殖壶菌的生物量,溶剂法提取油脂,并用GC分析DHA含量。结果表明:最适初始葡萄糖质量浓度和氮源质量浓度分别为80、15 g/L;菌种在26℃下培养48 h后,再将发酵温度降到22℃下培养120 h,其DHA含量为43.62%,DHA产量为5.23 g/L。在最佳条件下,50 L放大培养(先26℃培养48 h,后22℃培养96 h)后油脂产量可达14.8 g/L,DHA产量可达6.5 g/L。综上所述,裂殖壶菌具有较好的工业化生产潜力。     

维生素对裂殖壶菌发酵产DHA的影响

采用单因素研究了VB1,VB3,VB6,VB12,生物素5种B族维生素对裂殖壶菌Schizochytriumsp.JN-168发酵产DHA的影响。实验表明:适量地添加5种维生素中的任一种均可提高DHA的产量,5种维生素的最适的质量浓度分别为0.1,0.005,0.005,0.3,0.05 mg/L,在各自最适的质量浓度下,VB12对DHA产量的提高效果最好,VB6和VB3次之,生物素和VB1最差。将5种维生素以最适的质量浓度同时添加到发酵培养基中可以大幅度提高DHA产量,与对照相比提高了53.8%,亦远高于添加单一维生素的效果。     

裂殖壶菌不同破壁方法的研究

裂殖壶菌细胞结构紧密,对其进行破壁是二十二碳六烯酸(DHA)高强度发酵的重点工序。以裂殖壶菌为实验菌种,比较了水洗法、膜过滤法、高压均质法、酶解法和膜过滤高压均质法5种破壁方法,观察了每种方法破壁前后细胞形态特征,同时测定细胞破壁率、发酵液含油量、DHA产量和DHA含量。结果表明:膜过滤高压均质法效果最为理想,破壁率达到100%;膜过滤高压均质法的含油量、DHA产量、DHA含量均为最高,分别达到16.98 g/L、7.08 g/L、41.71%;从生产的连续性和有效性来讲,膜过滤高压均质法是最佳的破壁方法。     

裂殖壶菌的双碳源发酵生产二十二碳六烯酸控制策略

研究了葡萄糖、甘油双碳源发酵对裂殖壶菌发酵二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)的影响。首先以葡萄糖和甘油为单一碳源,发现以葡萄糖为碳源,菌体增殖速度和底物消耗速度都明显高于以甘油为碳源,以甘油为碳源细胞油脂中DHA的比例显著高于葡萄糖。为了发挥2种碳源各自优势,对葡萄糖和甘油双碳源发酵进行研究,结果显示2种碳源混合或葡萄糖耗尽后补加甘油结果都不如单一碳源好。但若先用葡萄糖为碳源进行培养,当发酵液中的葡萄糖质量浓度降至10～5 g/L时补加甘油既可以缩短发酵周期,又提高了油脂中的DHA比例。采用初始葡萄糖质量浓度为20 g/L,过程补加100 g/L甘油的发酵控制策略,5 L罐发酵,发酵周期可缩短至56 h,细胞油脂中DHA比例最高可达45.50%,充分发挥了2种碳源的优势。该研究得到了一种裂殖壶菌生产DHA葡萄糖、甘油分段发酵控制策略,大幅提高菌体细胞油脂中DHA的比例,同时有效缩短了发酵周期,具有非常好的工业应用价值。     

面向工业化的裂殖壶菌DHA油脂提取方法研究

研究液氮法、均质法、微波法、酶法等9种细胞破碎方法对裂殖壶菌单细胞油脂提取的影响,分别考察了各种细胞破碎方法提取得到的单细胞油脂含量、DHA含量、油脂中的脂肪酸分布以及耗时、耗能等情况,结果表明酶法和酸热法效果最好,其中酶法由于投入低、能耗少、操作简单等优点更具工业化潜力。将酶法与传统的均质法进一步放大对比,验证了酶法的优良性能。     

利用胞内核磁共振法快速筛选高产DHA裂殖壶菌的研究

采用化学试剂亚硝基胍和紫外结合的方式对生产用裂殖壶菌进行诱变。通过核磁共振法快速原位检测约三百个突变株的胞内油脂含量和DHA占总脂肪酸比例,综合考虑两个指标,筛选出性状较优良的10余个突变株。通过进一步对其各项指标的仔细检测,最终筛选得到一株DHA高产突变菌株。突变株生物量较野生菌株没有变化,油脂含量为68%,DHA占总油脂比例57%,比出发菌株分别提高17%和14%,该突变菌株被命名为Aurantiochytrium sp.KYX-01,其性状优异,非常适合工业化生产DHA油脂。     

使用稀禾定驯化提高裂殖壶菌的生长和DHA积累

采用基于实验室的微生物适应性驯化方法,对Schizochytrium sp.S31进行脂肪酸合成途径抑制剂稀禾定连续传代驯化,逐步提高稀禾定的驯化浓度。经过近200天连续驯化65代,Schizochytrium sp.S31对稀禾定的耐受浓度从200μmol/L提高到了500μmol/L。通过250 m L摇瓶发酵96 h后发现,驯化株的生物量明显高于野生株的生物量,其中驯化株ALE500的生物量最高,比相同时间点野生株的生物量高20.2%,二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)产量也提高了30.4%。此外,驯化株的脂肪酸不饱和度也有所提高,其中驯化株ALE500的不饱和度达到了1.11。采用5 L发酵罐验证驯化效果,结果显示驯化株ALE500的生物量和DHA产量分别提高了19.74%和29.38%。综上所述,使用脂肪酸合成途径抑制剂稀禾定对裂殖壶菌进行定向驯化的方法可以提高裂殖壶菌的发酵生物量和DHA产量。     

裂殖壶菌诱变株高产DHA机理的转录组学分析

利用RNA-seq技术对裂殖壶菌SR21的原始菌株和ARTP诱变所获取的DHA高产菌株NA2进行转录组分析。对基因进行功能注释和代谢通路的分类,寻找差异表达基因,并将这些基因归类到相关的代谢途径中,揭示诱变菌NA2中DHA产量提高的分子机理。结果表明:与原始菌株比较,诱变菌NA2中有314个基因上调,3个基因下调;上调的基因主要参与氨基酸代谢和能量代谢,为多不饱和脂肪酸的积累供应更多的乙酰辅酶A(乙酰-CoA)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)。利用荧光定量PCR验证基因的差异表达情况,结果与转录组分析一致。     

EMS-ARTP复合诱变选育高产DHA裂殖壶菌

为确定一种高效、稳定的选育高产DHA裂殖壶菌菌株的方法,将出发菌株Schizochytrium sp.31进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变和常压室温等离子体(ARTP)复合诱变,并将复合诱变方法与2种单因子诱变方法进行诱变效率、诱变后高产株发酵特性及遗传稳定性比较。结果显示,该复合诱变正突变率达到32.2%,远高于2种单因子诱变方法;复合诱变选育得到高产DHA裂殖壶菌菌株,其DHA生产能力和DHA含量分别达到7.2g/L和43.2%,比出发菌株分别高35.6%和19.2%;经过5代培养,其发酵指标稳定,遗传稳定性优于单因子诱变获得的菌株。该复合诱变方法是选育高产DHA裂殖壶菌菌株的有效手段,也为其它产多不饱和脂肪酸菌株的选育提供了参考。     

裂殖壶菌单细胞油脂的组分特性分析

为了获得完整的裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)油脂组分信息,以其单细胞油脂组分为研究对象,对裂殖壶菌单细胞油脂进行深入研究.结果表明:裂殖壶菌单细胞油脂占细胞干重的63.32％;单细胞油脂由87.864％的中性脂和11.322％的极性脂组成;单细胞油脂中DHA含量为41.45％;单细胞油脂中胆固醇、角鲨烯和β-胡萝卜素含量分别为40.93、19.99 mg/g和34.91 μg/g.经气相色谱-质谱联用分析表明:单细胞油脂的不皂化物中含有胆固醇、麦角固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、环阿屯醇和角鲨烯.     

Box-Behnken响应面法优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件的研究北大核心CSCD

为了优化裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化工艺条件,以DHA酯化率为指标,在单因素实验基础上采用Box-Behnken响应面实验设计,考察了无水乙醇用量、浓硫酸用量、反应温度和反应时间对裂殖壶菌油脂胞内转乙酯化的影响。结果表明:针对0.5 g干菌粉,得到最优的胞内转乙酯化工艺条件为无水乙醇用量11.76 m L、浓硫酸用量0.41 m L、反应温度75.5℃、反应时间2.24 h,在此条件下DHA酯化率达到85.19%。     

裂殖壶菌油脂水酶法提取工艺优化及其脂肪酸组成分析

采用水酶法对裂殖壶菌油脂的提取工艺进行研究,通过单因素和正交实验优化提取工艺条件,并对裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成进行分析。实验结果表明,水酶法提取裂殖壶菌油脂的最佳工艺条件:复合酶配比2∶8(纤维素酶∶中性蛋白酶,U∶U),液料比4 m L/g,加酶量2 500 U/g,酶解温度55℃,酶解时间4h;在此优化条件下,裂殖壶菌油脂提取率为82.47%。裂殖壶菌油脂脂肪酸以C14∶0、C16∶0、C22∶5n-6和C22∶6n-3为主,其脂肪酸组成简单,且C22∶6n-3质量分数高达32.65%,表明裂殖壶菌油脂具有很高的营养价值和功能性油脂的开发潜力,可作为C22∶6n-3的重要食药来源。     

温度对裂殖壶菌S31中FAS及PKS基因 转录水平的影响

以甘油为碳源,测定了摇瓶中裂殖壶菌S31进入脂质积累期后,温度对胞内油脂脂肪酸组成以及FAS和PKS基因转录水平的影响。结果表明:当裂殖壶菌进入脂质积累阶段后,提高发酵温度到30℃会减少藻油中DHA的含量,FAS基因的转录水平比PKS基因的更高;同时,降低发酵温度到20℃会提高裂殖壶菌S31藻油DHA的含量,PKS基因的转录水平显著高于FAS基因的。实验结果表明,温度对PKS和FAS基因的转录水平有显著的影响,从而决定裂殖壶菌S31中藻油脂肪酸组成的变化。