GⅡ.4型人诺如病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗GⅡ.4型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法 PCR扩增GⅡ.4型HuNoV VP1基因序列,将其插入至原核表达载体pGEX-5X-1中,构建重组质粒p GEX-5X-1-VP1,转化至E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并通过亲和层析纯化获得重组蛋白GST-VP1。利用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与经GST-VP1抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞进行融合,通过间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,并进行纯化。采用间接ELISA法、Biacore法和Western blot法分别检测单克隆抗体的效价、亲和力及特异性。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pGEX-5X-1-VP1构建正确。重组蛋白GST-VP1相对分子质量约85 000,大部分以可溶形式存在,纯化后浓度为1.100 mg/mL。筛选获得3株能分泌GⅡ.4型HuNoV VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为NoV C1、NoV D9和NoV H6,效价均可达1∶10~7以上,亲和力常数KD(M)分别为4.422×10~(-7)、4.303×10~(-8)、7.540×10~(-7 )mol/L,均可与HuNoV VP1天然蛋白及GST-VP1重组蛋白发生特异性结合。结论利用原核表达系统成功表达了GST-VP1蛋白,并通过杂交瘤技术制备了高效价的GⅡ.4型HuNoV VP1特异性单克隆抗体,为GⅡ.4型HuNoV免疫诊断和疫苗的研发奠定了基础。     

壳聚糖微珠亲和层析介质的制备及其初步应用

目的制备壳聚糖(CTS)微珠亲和层析介质,并进行初步应用。方法采用多种化学方法对CTS的表面基团进行改造,使其活化。用此改性CTS进行羊抗人IgG及小牛血清纤维连接蛋白(FN)的纯化。结果此改性的CTS微珠粒径在40￣160μm之间,每克可溶胀至4ml。活化的CTS对人丙种球蛋白的吸附量为15￣25mg/gCTS,对明胶的吸附量为5.8￣6.5mg/gCTS。采用此方法纯化的羊抗人IgG及FN与Sepharose4B法纯化效果一致。结论已制备的壳聚糖微珠亲和层析介质,其性质稳定且价格较低,是一种可以广泛应用的亲和层析介质。     

断裂内含肽介导的亲和介质与亲和标签的应用

应用Cfa断裂内含肽构建了一种新型的亲和纯化系统,并完成对目的蛋白无标签纯化。首先对Cfa断裂内含肽的IN片段与IC片段进行分子改造,通过研究在自由混合条件下的断裂情况,测定了其断裂速率。其次以改造后的IN片段作为配体与环氧活化的琼脂糖微球载体偶联,制备了IN亲和层析介质;IC片段作为亲和标签与目的蛋白GFP融合,并利用IN亲和层析介质实现对目的蛋白进行无标签纯化。结果表明,将IN与IC-GFP片段混合后,30s内即可断裂超过50%,4 h内即可完全断裂;IN亲和层析介质的静态载量为66.78 mg×m L~(-1),动态吸附载量约为30 mg×m L~(-1);纯化后的绿色荧光蛋白(GFP)纯度达到了96.7%,回收率为29.3%。Cfa断裂内含肽的应用为开发新型亲和纯化技术提供了一种潜在的方法。     

呼吸道合胞病毒截短G蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

目的构建呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)截短G蛋白的原核表达载体,并对表达、纯化后的蛋白进行免疫原性及相关免疫指标的检测。方法人工合成G蛋白基因的部分核酸序列,采用重叠PCR法将CX3C模序替换为RSV M蛋白上的CTL表位,构建原核表达载体GCX3C-pET22b和GCTL-pET22b,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE鉴定后,采用Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白。纯化产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,免疫昆明小鼠,实验分GCX3C组(100μg GCX3C)、GCTL组(100μg GCTL)、阴性对照组(100μlPBS),分别于0、1、4周经小鼠双后侧肌肉注射免疫,经尾梢静脉取血,分离血清,检测IgG水平及嗜酸性粒细胞的数量,并通过小鼠体外淋巴细胞杀伤试验鉴定RSV特异性CTL应答。结果重组原核表达载体经双酶切及测序鉴定,证明G蛋白基因改造成功;重组蛋白的相对分子质量约14 000,表达量约占菌体总蛋白的40%,主要以可溶性形式表达;纯化的重组蛋白纯度达90%以上,可与抗RSV血清发生特异性反应;小鼠血清中的特异性IgG水平随免疫次数的增加而升高(P<0.01),GCX3C蛋白和GCTL蛋白的几何平均滴度分别为1 584.89和1 995.26;GCX3C组较GCTL组小鼠血清中嗜酸性粒细胞数量明显增加(P<0.01);GCTL蛋白免疫小鼠后可产生RSV特异性的CTL应答效应。结论已成功原核表达了GCX3C蛋白和GCTL蛋白,两种蛋白均有较好的免疫原性,GCTL蛋白可消除由CX3C模序引起的嗜酸性粒细胞增多,并增强了CTL效应,G蛋白基因的改造达到了预期效果。     

肠道病毒71型3C基因原核表达质粒的构建表达及纯化

目的构建肠道病毒71型(Entervirus71,EV71)3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化。方法以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白GSR-3C经GST-Agarose亲和层析和分子筛层析纯化后,Western blot检测其反应原性。结果重组表达质粒pGEx-3C经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶性形式表达;纯化后的重组融合蛋白纯度大于90%,可与小鼠抗EV71单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pGEx-3C,在大肠杆菌中高效分泌表达并纯化了重组GST-3C融合蛋白,为EV713C蛋白酶结构与功能的研究及3C靶向药物和疫苗的研究奠定了基础。     

重组人脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及其纯化

目的原核表达并纯化重组人脂蛋白相关磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2),并初步确定其保存条件。方法将重组表达菌pCold TF-LP-PLA2-BL21(DE3)和pET28-HRV 3C-BL21(DE3)分别经IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后,经Ni-Sepharose 6FF金属螯合层析粗提重组蛋白,经HRV 3C蛋白酶酶切去除融合标签后,用Blue Sepharose誖6 Fast Flow(蓝胶)染料亲和层析及HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR分子筛进行分离纯化;通过人LP-PLA2临床检测金标准ELISA试剂盒验证重组蛋白;将重组LP-PLA2置于含10 mmol/L CHAPS和0.5 mmol/L PMSF的PBS溶液中,分别于4℃、室温、37℃保存1周以及-20、-80℃冻存4个月后,确立重组蛋白的保存条件。结果重组LP-PLA2相对分子质量约100 000,以可溶性形式表达,包涵体无表达;纯化后的重组LP-PLA2蛋白含量为3.68 mg/ml,蛋白回收率为21%,纯度可达95%,可被ELISA试剂盒识别,且具有良好的线性关系(R2=0.996 4);重组LP-PLA2于4℃保存1周,-20、-80℃冻存4个月,均无降解现象。结论成功表达、纯化了重组LP-PLA2,并初步确定了其保存条件。     

人呼吸道合胞病毒黏附蛋白片段的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)兰州株黏附蛋白(G)片段。方法利用PCR技术从HRSV兰州株(A亚型)中扩增G基因AA75-225片段,克隆至原核表达载体pET-42b(+)中,构建重组表达质粒pET-42b-G,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 PCR扩增获得453 bp的DNA片段;重组表达质粒pET-42b-G经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量为50 230,表达量占菌体总蛋白的25%,以包涵体和可溶性两种方式存在;纯化后重组蛋白纯度可达95%以上,可与抗RSV-G蛋白单克隆抗体特异性结合。结论已成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了HRSV兰州株G片段,为后续RSV疫苗的研制、RSV感染的血清学诊断及试剂盒的研发提供了材料。     

细胞周期蛋白依赖性激酶4重组蛋白兔血清抗体的制备及鉴定

目的 制备细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)重组蛋白兔血清抗体并鉴定其特性.方法 将设计合成的CDK4基因克隆至载体pET21a(+)中,构建重组质粒pET21a(+)/CDK4,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经镍螯合亲和层析纯化,...     

国产免疫磁珠与溴化氢活化Sepharose 4B亲和层析分离羊抗人IgG的比较

目的比较国产免疫磁珠与溴化氢活化Sepharose 4B两种不同介质偶联人免疫球蛋白纯化羊抗人IgG的差别。方法采用亲和层析的方法纯化羊抗人IgG,通过血凝实验检测不同介质纯化产物的效价和特异性。通过SDS-PAGE检测其纯度。通过计算偶联率及蛋白回收率,比较两种介质纯化效率。结果两种不同介质纯化的羊抗人IgG特异性良好,效价均为1∶512,SDS-PAGE检测均为单一条带。采用两种介质纯化羊抗人IgG,蛋白回收率分别为10·03%和17·45%。结论两种不同介质采用亲和层析方法纯化均可获得纯度较高的羊抗人IgG。     

结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。方法将ESAT-6基因自pET-24b-ESAT-6质粒亚克隆至pGEX-3C载体中,构建重组表达质粒pGEX-ESAT-6,经酶切及测序鉴定正确后,分别转化大肠杆菌JM107和BL21(DE3),以不同浓度IPTG诱导表达,表达产物经GSH-Sepharose4 B亲和层析纯化。结果所构建的重组表达质粒pGEX-ESAT-6经酶切及测序鉴定正确;重组融合蛋白在大肠杆菌JM107中的表达量较高,可达菌体总蛋白的24.2%;最适IPTG诱导浓度为0.1mmol/L;纯化的目的蛋白纯度可达83.9%。结论已成功构建了重组表达质粒pGEX-ESAT-6,并在大肠杆菌JM107中高效表达,为结核分枝杆菌亚单位疫苗及核酸疫苗的研制提供了材料。     

金黄色葡萄球菌α-毒素重组蛋白的免疫原性及其免疫保护性评价

目的评价金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)无毒性α-毒素(alpha toxin,AT)重组蛋白的免疫原性及其在金葡菌49521(CP5型)和49525(CP8型)菌株中的免疫保护作用。方法根据NCBI中hla基因参考序列(NC_007795.1),人工合成无毒突变hla H35L基因(即mhla基因)序列,克隆至pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-mhla,转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行Ni柱亲和层析纯化,SDS-PAGE分析目的蛋白(mAT)的可溶性。用重组蛋白mAT+氢氧化铝佐剂(试验组)和氢氧化铝佐剂(对照组)分别于0、14、28 d经腹部皮下免疫BALB/c小鼠,攻毒前1 d小鼠眼眶采血,检测血清中IgG抗体及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平;末次免疫10 d后,分别用致死剂量49521(6.0×108 CFU/只)及49525(3.0×109 CFU/只)菌液经腹腔感染两组小鼠,试验重复3次,统计小鼠存活率。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-28a-mhla构建正确。重组蛋白mAT相对分子质量约为34 000,以可溶性形式表达。纯化的重组蛋白mAT可诱导小鼠产生滴度为1∶580 000的IgG抗体,且以IgG1亚型(抗体滴度为1∶440 000)为主。试验组小鼠对49521 3次攻毒的保护率分别为75.0%、70.0%和83.3%,对49525菌的保护率分别为80.0%、60.0%和80.0%,均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均0.05)。结论金葡菌无毒性重组蛋白mAT具有较好的免疫原性和免疫保护作用,可作为多抗原组分疫苗研究的候选抗原。     

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65融合蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中融合表达绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A,PEA)受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65),并进行纯化。方法从含PEA的质粒中扩增PEA受体结合区亚基PEAⅠ,克隆至pET-28a-HSP65质粒中,构建重组表达质粒pET-28a-HSP65-PEAⅠ,转化大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析;利用抗PEA受体结合区单抗杂交瘤细胞制备抗PEA受体结合亚基单抗,偶联免疫亲和层析介质,将表达的重组蛋白经DEAE Sepharose 4FF阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和免疫亲和层析进行纯化。结果重组质粒经PCR鉴定及测序,证明构建正确;表达的重组HSP65-PEAⅠ蛋白相对分子质量约93 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上;抗PEA受体结合亚基单抗效价可达1∶10 000。纯化的重组HSP65-PEAⅠ蛋白纯度达90%以上。结论已成功在大肠埃希菌中表达并纯化了重组融合蛋白HSP65-PEAⅠ,为防止PA感染后多器官衰竭综合征的免疫制剂的研究奠定了基础。     

产肠毒素性大肠埃希菌K99-987P-F41原核表达载体的构建、表达及其纯化

目的构建产肠毒素性大肠埃希菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99-987P-F41原核表达载体,诱导表达后进行纯化。方法利用PCR技术,从ETEC基因组DNA中扩增出K99、987P、F41部分基因片段,将3段目的基因融合亚克隆至大肠埃希菌原核表达载体p ET30a(+),构建重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经镍离子亲和层析纯化。结果重组表达质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41经PCR、酶切及测序鉴定证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约60 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的63.8%,纯度为81.2%,浓度为8.953 mg/ml,可同时被天然和重组抗原多抗识别,具有良好的反应原性。结论 ETEC重组质粒p ET30a(+)-K99-987P-F41可在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍离子亲和层析柱纯化可获得融合蛋白。     

新德里金属-β-内酰胺酶的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1),并制备其多克隆抗体。方法以临床分离的产NDM-1的臭鼻克雷伯杆菌为模板,PCR扩增NDM-1基因,克隆入pET-28a载体,构建重组原核表达质粒pET-28a-NDM-1,转化E.coli BL21(DE3)pLyss,IPTG诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白经硫酸铵沉淀、离子交换层析、Ni亲和层析及分子筛层析纯化后,免疫日本大耳白兔,制备NDM-1多克隆抗体。抗体经硫酸铵沉淀和SPA-Sepharose亲和层析纯化后,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒pET-28a-NDM-1经PCR及测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为28 000,诱导表达的重组菌破菌上清存在较强的β-内酰胺酶活性,表明NDM-1蛋白为可溶性形式表达;最终纯化获得的NDM-1蛋白纯度高于95%;制备的NDM-1多克隆抗体能与诱导表达的重组菌胞外蛋白特异性结合。结论成功原核表达了NDM-1,并制备了其多克隆抗体,为NDM-1的快速检测提供了新的思路。     

白喉毒素无毒变异体CRM_(197)的表达及其载体作用

目的表达白喉毒素无毒变异体CRM197,并考察其载体作用。方法利用基因工程技术在大肠杆菌BL21(DE3)中表达CRM197,用金属镍离子亲和层析纯化;以重组CRM197为蛋白载体,在EDAC的作用下,与活化的A群脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)结合,制备GAMP-rCRM197结合物,免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法测定血清中A群脑膜炎球菌多糖特异性IgG抗体,并分析其免疫原性。结果重组CRM197在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的25%左右;Western blot证明重组CRM197具有良好的反应原性;各针接种后,结合物诱生的多糖特异性IgG水平均显著高于GAMP组和GAMP+rCRM197混合物组,具有较强的免疫原性;多次接种产生了免疫增强效应,重组CRM197具有载体蛋白的作用。结论已在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了重组CRM197,以纯化的重组CRM197作为载体制备的GAMP-rCRM197结合物具有良好的免疫原性,为以重组CRM197为蛋白载体制备其他结合疫苗奠定了实验基础。     

人心肌肌酸激酶MB同工酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人心肌肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)。方法分别从含CK-M、CK-B基因片段的质粒SC319293和SC119007中扩增CK-M、CK-B基因,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,经GST亲和层析柱纯化后,ELISA法检测其抗原性。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组CK-MB蛋白相对分子质量约110 000,表达量占菌体总蛋白的57%,主要以包涵体形式存在;纯化的CK-MB蛋白纯度大于90%,可与兔抗CK-B、CK-M多克隆抗体特异性结合。结论成功原核表达并纯化了重组CK-MB蛋白,为其大量生产奠定了基础。     

中蜂囊状幼虫病病毒结构蛋白的表达及其抗血清的制备

目的原核表达中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sarbood virus,CSBV)结构蛋白,并制备其抗血清。方法采用RT-PCR法扩增CSBV结构蛋白基因片段,克隆至pGEX-4T-1载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Gluthathione-Sepharose 4B亲和层析纯化后,免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒经菌落PCR鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约52 000,以可溶性形式表达;纯化后纯度可达95%以上;制备的抗血清可识别天然CSBV结构蛋白。结论成功在大肠杆菌中表达了CSBV结构蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研究囊状幼虫病病毒与宿主的相互作用及开发血清学诊断方法奠定了基础。     

重组肺癌抑癌基因1蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的表达、纯化重组人肺癌抑癌基因1(Tumorsuppressor in lung cancer1,TSLC1)蛋白,并制备其多克隆抗体。方法采用RT-PCR法扩增TSLC1基因全长编码区序列,克隆入原核表达质粒pQE30,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,免疫家兔,ProteinA亲和层析纯化抗血清,并经Westernblot分析其反应原性。结果重组表达质粒pQE30-TSLC1经双酶切及测序鉴定证明构建正确。重组TSLC1蛋白的表达量约占菌体总蛋白的14%,主要以包涵体形式存在。纯化的重组蛋白纯度为93.4%,可与小鼠抗His-Tag单克隆抗体发生特异性反应。以其制备的多克隆抗体具有良好的抗原识别特异性。结论已成功制备TSLC1多克隆抗体,为深入研究TSLC1分子的生物学活性奠定了基础。     

应用于抗体药物捕获的耐碱亲和层析介质性能的比较

目的比较应用于抗体药物捕获的耐碱的4种蛋白A亲和层析介质和2种小分子亲和层析介质的性能,为单抗纯化工艺的选择提供参考。方法利用两种单抗纯品(mAb1和mAb2)测定4种蛋白A亲和层析介质MabSelectSuRe、POROS MabCaptureA、Absolute High Cap、TOYOPEARL AF-rProtein A-650F和2种小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF、Fabsorbent F1P HF在停留时间分别为4、6、8 min时的动态载量;利用含mAb2的发酵液,从回收率和杂质去除方面比较6种亲和层析介质的纯化效果。结果在5%穿透点,各介质对mAb1和mAb2的动态载量在35~73 g/L之间。小分子亲和层析介质Mabsorbent A2P HF纯化mAb2的回收率为89%,其他5种介质纯化mAb2的回收率均≥96%;6种介质纯化mAb2的宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)在2 000 ppm之内,蛋白A残留量在20 ppm之内。结论结合流速、动态载量、回收率和杂质去除效果等指标,可从6种亲和层析介质中挑选适用于抗体类药物下游纯化工艺的耐碱型蛋白A或小分子亲和介质。     

丹参-葛根药对提取物的纯化工艺及抗氧化活性研究

为了将丹参-葛根药对粗提物进一步加工成抗氧化保健品,研究该粗提物的大孔树脂纯化工艺。以丹酚酸B、葛根素含量为指标,通过对九种大孔树脂的静态吸附量和解吸率的考察,筛选出合适的树脂,优化纯化工艺。同时采用DPPH自由基法测定粗提物、纯化物的抗氧化活性。结果表明:D101型大孔树脂的纯化工艺为:上样浓度30 mg·mL~(-1),上样量2 BV,除杂剂水用量为3 BV,洗脱剂乙醇浓度为50%,用量为3.5 BV。经树脂纯化后,丹酚酸B和葛根素的含量分别提高了3.33倍、4.03倍,多糖含量明显降低,丹参-葛根提取物清除DPPH自由基的IC_(50)由0.048 3 mg·mL~(-1)降至0.010 4 mg·mL~(-1),抗氧化能力显著增强。该纯化工艺有效地提高了丹酚酸B和葛根素的含量,利于抗氧化保健品的研发。