蚯蚓组织脱氧核糖核酸酶EWD3的生化性质

目的研究赤子爱胜蚓组织中1种脱氧核糖核酸酶(EWD3)的主要生化性质。方法采用Lowry法测定酶的蛋白含量,SDS-PAGE和MALDI-TOF方法测定相对分子质量,毛细管等点聚焦电泳法测定等电点,并测定EWD3酶的酸、碱稳定性、温度稳定性、激动剂和抑制剂对酶活性的影响及酶促反应米氏常数Km值。结果EWD3酶的蛋白含量为2.1 mg/ml,相对分子质量为63 460,等电点为6.20,Km值为1.52 mg/ml,最适pH值为4.4~5.2,不耐高温。Mg2+、Ca2+、Mn2+1、0和20 mmol/LEDTA对EWD3酶活性有抑制作用。这些参数与已发现的各种DNases相比有明显差异。结论蚯蚓组织中已发现的脱氧核糖核酸酶EWD3具有特殊的酶学特征。     

赤子爱胜蚓蛋白磷酸酶2A类似激活剂样蛋白cDNA和氨基酸序列分析

目的分析赤子爱胜蚓蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)类似激活剂样蛋白的cDNA和氨基酸序列。方法从赤子爱胜蚓cDNA文库中随机测序得到目标cDNA序列,应用DNAMAN、NCBI ORF finder、BLAST、Conserved Domains、GOR、SWISS-MODEL、PDB等基因和蛋白质分析软件进行该目标基因测序及氨基酸序列分析。结果赤子爱胜蚓PP2A类似激活剂样蛋白cDNA序列长547 bp,编码87个氨基酸残基;与该蛋白基因序列相似度较高的多是不同物种中PP2A类似激活剂蛋白基因序列,其中与Crassostrea virginica serine/threonine-protein phosphatase 2A activator-like mRNA核苷酸相似度为67%;与该蛋白氨基酸序列相似度较高的多是不同物种中的PP2A类似激活剂蛋白氨基酸序列,其中与serine/threonine-protein phosphatase 2A activator(Crassostrea gigas)氨基酸相似度为70%;目标序列中存在一段PTPA超家族保守结构域,蛋白质二级结构以α螺旋以及无规则卷曲为主,三级预测结果与二级结构一致。结论本实验分析的赤子爱胜蚓PP2A类似激活剂样蛋白与牡蛎PP2A类似激活剂蛋白及存在于所有真核生物中且高度保守的PTPA同源度较高,可能具有特异性激活肿瘤抑制因子PP2A的间接抑制肿瘤作用。     

两种蚯蚓生态滤床对垃圾渗滤液处理的对比试验

将抗逆性较强的赤子爱胜蚓和微小双胸蚓引人生态滤床,使蚯蚓在微生物的协同作用下分别对垃圾渗滤液进行净化处理。结果表明在净化垃圾渗滤液中的COD方面,微小双胸蚓的处理效果明显强于赤子爱胜蚓;在净化垃圾渗滤液中的NH3-N方面和改善垃圾渗滤液的pH方面,两种蚯蚓的处理效果基本相同。根据两种蚯蚓处理垃圾渗滤液过程中对胁迫生态环境的适应能力的监测结果来看,微小双胸蚓明显强于赤子爱胜蚓。根据对两种蚯蚓对重金属富集效果的检测结果来看,两种蚯蚓对于不同重金属的富集能力存在差异。     

重组人白细胞介素1β的纯化及单抗制备

利用NaCl梯度洗脱DEAE-Sepharose cL-6B柱层析纯化重组人白细胞介素1β(rhlL-1β)。rhlL-1β成分在100mmol/L NaCl浓度处被洗脱,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为一条带,分子量约17.5KD。以此产品作为抗原,可制备出具有良好特异性的抗IL-1β单克隆抗体。     

赤子爱胜蚓Calreticulin的cDNA和氨基酸序列分析

目的分析赤子爱胜蚓Calreticulin的cDNA和氨基酸序列。方法从本院构建的赤子爱胜蚓cDNA文库中经测序获得其Calreticulin cDNA序列。采用生物信息学分析工具DNAMAN、NCBI ORF finder、ExPASy Protparam、ExPASY Protscale、NCBI Conserved Domains、SignalP 4.1 Server、TMHMM Server v.2.0、SOSUI、NetPhos 3.1 Server、PSORT、SOPMA、ExPASy COILS、SWISS-MODEL分别对Calreticulin的cDNA序列、氨基酸序列、一级结构基本理化性质、亲/疏水性、保守结构域、信号肽、跨膜区、可溶性、磷酸化修饰、亚细胞定位、二级结构、卷曲螺旋域以及三级结构进行预测及分析。结果赤子爱胜蚓Calreticulin cDNA序列长476 bp,其中包含354 bp的开放阅读框,编码118个氨基酸残基;Calreticulin由19种氨基酸组成,呈酸性,为稳定的可溶性亲水蛋白;具有1段Calreticulin超家族保守结构域;不存在信号肽和跨膜结构;具有12个潜在的磷酸化位点;主要存在于细胞核中;二级结构元件主要由α-螺旋(29.66%)和无规则卷曲(50.85%)组成,具有卷曲螺旋;三级结构预测结果与二级结构一致。结论掌握了赤子爱胜蚓Calreticulin的理化性质,预测了其潜在的特征,并分析了其结构,为后续深入开展其功能及分子作用机制的研究提供了理论依据。     

硅胶柱层析法纯化粗品茄尼醇

采用柱层析、薄层层析（TLC）跟踪法精制茄尼醇粗品,考察了硅胶目数、上样量、洗脱剂及洗脱方式对纯化效果的影响。结果表明,柱层析适宜的工艺条件为：硅胶目数100～200目,茄尼醇粗品上样量3.5g,石油醚与丙酮混合液作洗脱剂,采用梯度洗脱方式。最终得到纯度90%以上的茄尼醇。     

重组人促红细胞生成素聚乙二醇修饰及纯化研究

目的　研究重组人促红细胞生成素 (rhEPO)聚乙二醇修饰条件及纯化方法。方法　用SDS PAGE分析不同反应条件对产物成分的影响 ;用红细胞压积法测定各组分的体内生物学活性 ;用分子筛柱层析进行纯化。结果　rhEPO的修饰度随蛋白浓度、蛋白与PEG2 NHS活性酯质量比的增加而提高 ,体内生物学活性随修饰度增加而降低 ,分子筛柱层析纯化效果好。结论　确立了rhEPO聚乙二醇化的影响因素及纯化方法     

SDS—PAGE测定大蒜功能性蛋白的相对分子质量

建立用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS—PAGE）测定大蒜功能性蛋白的组成及相对分子质量（Mr）。通过电泳考察大蒜冻干粉中的蛋白组分,对标准蛋白进行直线回归分析,确定大蒜冻干粉中功能性蛋白的相对分子质量。此法供试品的处理方便、用量少,分离胶（交联度为10．0％,丙烯酰胺总浓度为3．0％）中能较清晰显示相对分子质量低的蛋白条带,是一种测定相对分子质量低蛋白较好的方法。     

“人流血”中早孕因子的分离、纯化及鉴定

目的　分离、纯化并鉴定“人流血”中的早孕因子。方法　采用DEAE纤维素离子交换层析 ,S Sepharosefastflow离子交换层析 ,ConA SepharoseCl 4B亲和层析 ,Heparin SepharoseCl 6B亲和层析等方法进行纯化。用花结抑制实验检测出其活性。以SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其肽图。以等电聚焦电泳法检测其等电点。结果　从人流血中分离出EPF活性样物质 ,其蛋白含量为 0 .375mg/ml,SDS PAGE见 1条均匀带 ,其相对分子质量为2 6 5 0 0 ,等电点为 6 .87。结论　本研究提取的早孕因子性质与国内外报道的从妊娠初期孕妇血清中提取的基本一致     

生防甲基营养型芽孢杆菌Hg18抗菌蛋白的分离纯化及性质研究

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)Hg18是一种新型生防类细菌,能产生多种抗菌活性物质.通过50％(NH4)2 SO4饱和溶液沉淀透析除盐,从甲基营养型芽孢杆菌Hg18中分离到抗菌粗蛋白,经凝胶过滤层析、离子交换层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化得到抗菌蛋白,并对抗菌蛋白的性质进行了...     

蚯蚓脱氧核糖核酸酶的底物特异性及降解产物的特性

目的研究蚯蚓组织中一种新型脱氧核糖核酸酶(EWD)的底物特异性及降解产物的特性。方法采用ZOR-BAX-Oligo柱-HPLC、琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度法等技术,分析EWD对环状质粒DNA、线状λ-DNA、大肠杆菌基因组的降解作用,及对真核鲱精DNA、单链DNA等的降解中间产物和终产物的特性,并观察其对RNA的降解作用。结果EWD对这几种DNA均有降解作用,降解产物为较均一的、小于18bp的寡核苷酸。但EWD对RNA无降解作用。结论EWD为脱氧核糖核酸内切酶类。     

重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和鉴定

目的观察两次切胶、两次电洗脱的方法纯化重组日本血吸虫14-3-3(Sj14-3-3)蛋白的效果。方法采用两次切胶、两次电洗脱的方法(与经典的切胶、电洗脱有所不同),纯化Sj14-3-3蛋白,并与柱层析纯化方法进行比较。结果采用两次切胶、两次电洗脱方法纯化的目的蛋白条带单一,浓度达3mg/ml,而柱层析法纯化的蛋白浓度仅为1mg/ml。Western blot证实纯化目的蛋白的特异性。结论两次切胶、两次电洗脱法可获得高纯度、高特异性的目的蛋白,不失为一种经济有效的蛋白纯化方法。     

破伤风毒素及其片段的纯化

本文报道了破伤风毒素及其片段AB、BC、A和C的纯化方法。应用硫酸铵沉淀和Ultrogel AcA_(34)凝胶过滤制备的纯化毒素,于SDS-PAGE和PAGE中均形成单一的蛋白带,分子量为15万,pI为5.95,毒力为1～3×10~4MLD/μg。毒素经DTT还原、尿素处理、再用Ultrogel AcA_(44)凝胶过滤制备A和BC片段。A片段的分子量为54000,pI为4.8。BC片段的分子量为98 000,pI为7.2。木瓜酶处理毒素后用高压液相层析制备AB和C片段。纯化的AB片段分子量为98 000,于等电聚焦中为2条主要区带,pI为5.3和5.5,另有数条小区带;纯化的C片段分子量为51000,于PAGE中形成5条蛋白带,于等电聚焦中主要区带的等电点为7.3,另有几条小区带。     

柱色谱法纯化马铃薯叶中的茄尼醇

通过柱色谱法从马铃薯叶的提取物中分离提纯了茄尼醇,并以RP-HPLC法测定了茄尼醇的质量分数。采用硅胶对茄尼醇进行吸附纯化,以茄尼醇的实测收率、质量分数为考察指标,通过对硅胶颗粒、洗脱剂流速、洗脱剂组分配比进行考察,确定了茄尼醇的柱色谱优化条件。结果表明,以200~300目硅胶为填料,流动相流速为2.0 mL/m in,洗脱剂以石油醚、V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=20∶1、15∶1、9∶1进行梯度洗脱,茄尼醇的质量分数达到85.37%,重结晶后达到97.47%。     

重组人IL-31蛋白纯化方法的比较研究

目的比较两种方法纯化rhIL-31的效果。方法将含pET32a/rhIL-31的重组菌E.coli.BL21(DE3)经IPTG诱导表达,通过超声波破碎,包涵体的提取溶解,分别经G75凝胶层析和镍琼脂糖凝胶FF层析进行蛋白纯化,通过SDS-PAGE对纯化结果进行比较分析。结果镍琼脂糖凝胶FF层析法的杂蛋白去除率高于凝胶层析法,所得蛋白纯度略高。结论比较重组人IL-31蛋白的纯化效果,镍琼脂糖凝胶FF层析的效果比G75凝胶层析的效果好。     

重组人Tau蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 重组人Tau蛋白的诱导表达和纯化。方法 将携带 Tau蛋白基因的工程菌株经IPTG诱导表达后,通过超声破碎、硫酸按盐析、离子交换层析、电洗脱等方法纯化Tau蛋白,以SDS-PAGE、非变性PAGE、Westem blot和N末端氨基酸测定等方法进行鉴定。结果 纯化Tau蛋白的得率为28.5％,在SDS-PAGE和非变性PAGE上呈均一的蛋白条带,其相对分子质量约为59000,N末端5个氨基酸测定结果为NH2-Met-Ala-Glu-Pro-Arg-。结论 本实验采用纯化重组人Tau蛋白方法是可行的。     

人α_1型基因工程干扰素的中间试制

带有杂交质粒pBV867的大肠杆菌BMH 71-18株,用高密度发酵培养法进行发酵,3批中试的平均菌产量为100.25克/升,粗制干扰素的表达量平均为8.39mg/升。3批粗制干扰素的数量分别为35000,30000和36000 ml。经初步提纯,分别浓缩10.4、10和11.29倍,比活性上升10、33和30倍,初步提纯的得率为34.33％。经高度提纯、浓缩23.8、16.7和26.1倍,比活明显增加至24.38、20.80和21.43×10~6 IU/mg蛋白,平均得率为35.92％,总得率为11.82％,平均提纯倍数为1757倍。 3批中试产品按WHO规程的标准进行检定,经SDS-PAGE银染色法测定,呈一条带,其分子量约为21000,无论在还原或非还原的条件下干扰素纯度均在95％以上。用HPLC检定均为单一峰形,纯度在95％以上。其它检定项目如等电聚焦、效价、热原、残余DNA、鼠IgG含量测定和全波长扫描等均合乎规程要求。     

应用柱层析法纯化Vero细胞乙型脑炎疫苗

浓缩Vero细胞乙脑疫苗经SepharoseCL－6B柱层析可去除大部分杂蛋白，再经SphacrylS－500HR层析可进一步去除比病毒大的杂质及残余小分子量杂蛋白。经两步凝胶过滤层析纯化后，疫苗总蛋白含量减少约99％，抗原比活性提高87～165倍，抗原回收率达30％～50％，残余牛血清和残余细胞DNA均符合WHO有关规程要求，提纯疫苗的效力达到或超过中国地鼠肾灭活乙脑疫苗和日本提纯鼠脑拔苗的参考苗。     

鳊肌肉中有机磷不同净化方法的对比研究

为了找出一种更适合鳊肌肉中有机磷的净化方法.文章将鳊肌肉中有机磷提取液分别进行基质固相分散技术、SPE柱、GPC（全自动凝胶渗透色谱）净化,然后进行对比研究.表明：样品量大的情况下,并且资金足够,应选择GPC净化;样品量大资金不足,净化要求不高的情况下考虑选择分散固相净化;样品量少,资金不足但净化要求高,可以选择固相萃取柱净化.