柯萨奇B组1型病毒株MSH-KM9-09的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackievirus B1,CVB1)分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试验,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对分离株进行鉴定,RT-PCR法扩增病毒全长VP1基因,进行序列测定,并采用Mega 4.1等软件进行分析。结果所分离的毒株经微量中和试验定型为CVB1亚型,编号为MSH-KM9-09。经RT-PCR扩增获得834 bp的VP1基因,与国内CVB1分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在86.1%和97.8%以上,与国外CVB1分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.2%～83.2%和94.3%～96.0%;在系统进化树上,MSH-KM9-09株与国内分离株属于同一个分支,而国外分离株分属其他两个不同的分支。结论 MSH-KM9-09分离株为肠道病毒CVB1。     

一株柯萨奇病毒B2分离株的VP1基因序列特征分析

目的分析一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)B2分离株(CVB2)全VP1基因序列特征。方法用RD细胞对10份HFMD疑似患儿的粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1基因,并测序,采用NCBI BLAST、Mega 6.1和Geneious等软件进行序列分析,并构建系统进化树。结果从10份HFMD疑似患儿粪便中分离到一株CVB2,命名为509/YN/CHN/2010,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVB2一致,均为846 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~95.3%和97.9%~98.9%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.1%~87.8%和97.9%~98.6%。在进化树上与其他中国分离株分属不同的两个分支,而与M10MG17亲缘关系较近。结论 509/YN/CHN/2010分离株为肠道病毒CVB2,为两个中国分支中的一支。     

一株柯萨奇病毒A9分离株的VP1基因遗传特征分析

目的分析引起病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)的一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)A9分离株(CVA9)的VP1基因遗传特征。方法采用KMB17细胞对VE患儿粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1全基因,并测序,采用Mega 6.1和Geneious 5.6.5等软件分析其序列,并构建系统进化树。结果从5份VE患儿粪便中分离到一株人CVA9,命名为A108/YN/CHN/2009,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVA9一致,均为906 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4%~98.2%和96.4%~99.3%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~96.0%和92.7%~99.0%。在进化树上与其他中国分离株属同一分支中不同两个亚分支,与JB141230009亲缘关系较近。结论 A108/YN/CHN/2009分离株为肠道病毒CVA9血清型,与其他中国分离株同属一个基因簇。     

2019年云南省昆明市柯萨奇病毒A组16型毒株的分离鉴定及其VP1基因遗传特征分析

目的 对2019年云南省手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）患者粪便中分离获得的柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）毒株的全VP1基因遗传特征进行分析。方法 使用人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞分离病毒,设计针对CVA16全VP1基因序列引物,采用RT-PCR扩增目的基因片段并测序;利用MEGA 7.0和Geneious 9.0.2等软件对全VP1序列进行分析。结果 共分离获得26株CVA16毒株,其中有8株KMB-17分离株和18株Vero分离株。随机选取20株CVA16分离株进行分析,发现3株B1a和17株B1b基因亚型;其中17株CVA16 B1b分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.8%～100%和98.3%～100%,与国内其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性为91.1%～99.2%和97.3%～99.0%;3株B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为98.0%～98.1%和99.3%,与国内其他B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为88.7%～98.7%和98.3%～99.7%;17株B...     

2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。     

一株鼻病毒A22型的分离鉴定及其VP1基因遗传特征分析

目的分析2011年昆明市手足口病患儿粪便中分离获得的人鼻病毒(human rhinovirus,HRV)A22型分离株KM4/2011全长VP1基因的遗传特征。方法采用KMB17细胞对手足口病患儿粪便样本中筛查出的1株HRV样品进行病毒分离,应用RT-PCR法扩增病毒VP1基因,并进行测序,采用BLAST软件对所测定的节段序列进行数据库比对;采用Geneious basic 5.6.5软件进行核苷酸和氨基酸同源性比对;采用Mega 5.05软件将HRV A22及部分HRV A、B和C群全长VP1基因构建系统进化树。结果分离株为KM4/2011,经扩增、测序和序列拼接获得长度为867 bp的VP1基因;KM4/2011株与其他HRV分离株核苷酸和氨基酸的同源性分别为48.1%~91.0%和38.2%~97.6%,其中与HRV A22分离株的核苷酸和氨基酸同源性较高,分别为90.8%~91.0%和97.3%~97.6%;基因进化树分析显示,KM4/2011株与HRV A22基因型属于同一个进化分枝。结论 KM4/2011分离株为HRV A22型,存在地域差异。     

肠道病毒71型甘肃分离株VP1基因特征分析

目的分析肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)甘肃分离株VP1基因的特征。方法应用RT-PCR法扩增4株EV71甘肃分离株(46F、47F、51F和55F)的VP1基因,克隆入pTA2载体,进行核苷酸序列测定,并进行序列的同源性比较及进化树分析。结果 4株病毒VP1核苷酸序列长度均为891bp,推导的氨基酸序列含297个氨基酸。51F与55F毒株核苷酸和氨基酸同源性均为100%,46F与47F的同源性分别为99.6%和99.0%,4株病毒与EV71的C4亚型毒株核苷酸同源性在96%以上,氨基酸同源性在99%以上。同源性和进化树分析显示,4株分离株分属2个群,其中51F和55F毒株同属一个群,其与昆明分离株kunming41-08亲缘关系最为相近;46F和47F同属一个群,其与内蒙分离株0723F/NM/CHN/07关系最为相近。结论 4株EV71甘肃分离株属于C4亚型,为中国EV71的基因分型、分子流行病学研究提供了参考。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

吉林省2011年手足口病死亡病例肠道病毒71型分离株全基因组基因特征分析

目的分析吉林省2011年手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)死亡病例标本中分离获得的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)毒株全基因组基因特征。方法采用分段RT-PCR法对2011年吉林省HFMD死亡病例EV71分离株JL2011-56全基因组进行扩增和测序。利用Clustal X2和MEGA5软件构建分离株JL2011-56与Gen Bank中27株参考株的全基因组序列和VP1区全基因组序列的进化树,分析Jl2011-56株的流行病学特征;同时与Gen Bank中12株C4a基因亚型参考株进行全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。结果 JL2011-56分离株属于C4a亚型,核苷酸序列和氨基酸序列与山东分离株SDLY107(JX244186.1)同源性最高,分别为99.2%和99.5%,与EV71原型株Br Cr的同源性分别为79.9%和95.7%。结论 JL2011-56分离株与山东株亲缘关系较近,可能存在共同的与中枢神经毒力相关的氨基酸突变位点。     

一株引起病毒性脑炎的埃可病毒30型分离株的VP1基因序列特征分析

目的分析2009年昆明市病毒性脑炎患儿粪便中分离获得的埃可病毒30型(Echovirus30,Echo30)分离株A363/KM/2009全长VP1基因序列特征。方法从疑似病毒性脑膜炎患儿粪便样本中分离Echo30,提取病毒RNA,采用RT-PCR法扩增病毒VP1基因,并进行测序。采用NCBI BLAST软件对所测定的序列进行数据库比对;采用Geneious软件对Echo30分离株全长VP1基因的核苷酸及氨基酸同源性进行分析;采用Mega 5.1软件对A363/KM/2009分离株进行VP1基因分析,并与20个参考株的VP1序列进行比较。结果分离株为A363/KM/2009,其VP1基因的核苷酸长度与其他Echo30一致,均为867 bp;与其他Echo30分离株核苷酸同源性在76.9%~95.7%之间,氨基酸同源性在88.7%~99.7%之间;与中国株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为84.5%~95.7%和96.9%~99.7%,其中与中国浙江分离株Echo30/zhejiang/10/4的同源性最高,为95.7%;与广西分离株GX10/15的同源性最低,为84.5%。氨基酸序列分析显示,与其他中国株包括脑脊液分离株相比,未见特异的突变位点;与国外分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为76.9%~86.3%和88.7%~97.3%;基因进化树分析显示,与其他中国株分属不同的两个分支,而与Echo30/zhejiang/10/4和Echo30/zhejiang/4/04(CSF)株亲缘关系较近。结论 A363/KM/2009分离株为肠道病毒Echo30,属于中国两个分支中的一支。     

肠道病毒71型吉林分离株的全基因组序列分析

目的对2011年吉林省肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)分离株全基因组进行序列分析。方法将手足口病伴发重症脑炎患者的粪便样品接种至Vero细胞,分离EV71;采用RT-PCR法分8段扩增全基因组序列,进行双酶切及序列测定;应用Mega5软件构建EV71系统进化树;通过DNAMAN7和DNASTAR7软件进行EV71分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性比较;经RDP4软件对EV71分离株进行同源重组分析。结果粪便样品接种至Vero细胞2 d后,细胞出现圆缩、透亮、聚堆的病变现象;各PCR扩增产物经双酶切鉴定,均可见与预期大小一致的目的条带;经种系进化树分析显示,EV71分离株属C4a亚型,命名为EV71-JiLin-11-China;其与A、B和C亚型间核苷酸序列的平均同源性分别为22.44%、17.72%和11.96%,与A、B和C亚型间氨基酸序列的平均同源性分别为96.0%、97.2%和97.3%;全基因同源重组分析显示,EV71分离株的165～1 946和7 289～7 366核苷酸区有重组现象,分别源于分离自湖北的C4a-EV71-Hubei-09-China及马来西亚的B4-SB2864-SAR-00和C1-S18062-SAR-98。结论 2011年吉林地区流行的EV71为C4a基因型,为EV71基因特征及流行病学的研究提供了实验依据。     

安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒的N基因序列分析

目的对安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的N基因进行序列分析,并比较其与代表性RABV街毒株及疫苗株之间的差异。方法采集安徽省淮北地区狗肉市场的犬脑组织121份,伤人犬脑组织10份,采用直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测RABV抗原,并通过颅内接种昆明乳鼠进一步鉴定毒株;RT-PCR扩增分离病毒的N基因,与pMD18-T载体连接测序后,与代表性RABV街毒株及疫苗株的N基因序列进行比对,并进行遗传学分析。结果在送检的131份犬脑组织样品中检出RABV阳性19株,其中伤人犬脑组织阳性率为90%,狗肉市场犬脑组织阳性率为8.26%。19株RABV N基因核苷酸序列同源性为97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性为98.7%～100%;与代表性人用和兽用RABV疫苗株相比,N基因核苷酸序列同源性为85.4%～89.9%,推导的氨基酸序列同源性为94.9%～99.1%,核苷酸序列的变异主要为同义突变。分离的19株RABV在系统进化树上高度聚集,与以往国内分离的代表性街毒株系统进化关系较近,在同一个分支(HN10除外)与我国疫苗株CTN-181株亲缘关系最近,处于同一个亚群。结论从安徽省伤人犬和狗肉市场的犬脑组织中成功分离并鉴定了19株RABV,这些病毒株均属于基因I型RABV,且具有地域性特征。本研究对特定区域RABV的流行及监测具有一定的意义。     

广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析

目的对广西流行的猪瘟病毒E2基因进行序列测定及分析。方法应用PCR对15株猪瘟病毒E2基因进行扩增、克隆及测序,利用DNAstar分析软件对所测定的15株毒株与兔化弱毒(HCLV)、石门(Shimen)毒株的相应基因片段进行同源性分析。结果得到长度为1092nt猪瘟病毒E2基因,编码364个氨基酸残基的目的基因片段。广西株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为81.5%～82.8%和82.8%～84.3%,推导的氨基酸同源性分别为87.1%～88.8%和88.5%～89.9%,广西毒株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为92.3%～99.9%和94.8%～100%。广西15株猪瘟病毒E2蛋白上的全部半胱氨酸(Cys)位点均未改变,推测其E2蛋白的抗原结构保持很高的稳定性。但广西毒株中与特定单克隆抗体结合的724、725、729、734和738位的氨基酸发生了变异,这些变异可能导致不完全免疫保护。把所测定的广西15株与国内外已发表的19株病毒相应序列进行比较,建立系统发育树,所比较的34株猪瘟病毒被分为两个群,广西毒株皆属于基因群Ⅱ。结论成功进行了广西流行猪瘟病毒E2基因序列分析,为进一步探讨猪瘟病毒E2蛋白的抗原结构提供了依据。     

轮状病毒LLR疫苗株VP7基因的遗传变异研究

目的研究轮状病毒(RV)LLR疫苗株VP7基因的遗传特征,为疫苗的质量控制和发展提供依据。方法将LLR株轮状病毒毒种LLR38在原代牛肾细胞上连续传至49代。提取第38、43、44、49代病毒RNA。通过RT-PCR扩增VP7基因片段,将其克隆入质粒pGEM-T中,进行序列测定与分析。结果LLR株VP7基因全长1062bp,含编码326个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF)。各代次病毒的VP7基因核苷酸与推导的氨基酸变化完全一致,与GenBanK中LLR参考株(L11602)同源性分别为99.9%和99.7%。与14株G10血清型RV毒株之间,核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为84.3%～87.4%和92.7%～94.9%;与不同血清型RV代表株间,VP7基因核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为62.2%～76.8%和72.9%～83.1%;在A、B、C3个重要抗原表位,LLR株与同一血清型RV代表株B223氨基酸同源性高达97.5%,而与不同血清型仅为42.5%～62.5%。结论轮状病毒LLR疫苗株VP7基因具有良好的遗传稳定性,与来自不同国家同一型别的RV株VP7蛋白氨基酸序列之间无明显差异,在遗传上密切相关,从VP7基因分子水平证明LLR株毒种及其制备的疫苗是安全可靠的。     

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

33株柯萨奇病毒A组16型分离株的全基因序列分析

目的对2008～2010年北京和青岛地区流行的33株柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)分离株的全基因序列进行分析。方法收集2008～2010年北京和青岛地区CA16感染患者咽拭子标本,采用Vero细胞对病毒进行分离,并经噬斑纯化。提取病毒RNA,采用RT-PCR法分段扩增CA16全长基因,经序列测定和拼接后,利用DNAStar和MEGA5.10软件分析全基因序列。结果经病毒分离和噬斑纯化,共获得33株CA16分离株;33个分离株之间的核苷酸序列同源性大于90.9%,与CA16国际标准株G10各区段的核苷酸序列同源性为72.7%～89.0%,氨基酸序列同源性为79.3%～100.0%;与近年中国分离的CA16 SZ/HK08-7株同源性较高,全基因组同源性大于91.5%,各区段核苷酸序列同源性均大于83.7%;在基于VP1序列的种系进化树中,BJWG16、BJWG17、BJWG20等23个分离株属于C1亚型,其余10个分离株属于C3亚型。结论 2008～2010年北京和青岛地区流行的33株CA16分离株均为C基因型。本研究对我国CA16分子流行病学、毒力位点的研究以及疫苗株的选择具有重要意义。