人碱性成纤维细胞生长因子在植物毛状根和毕赤酵母中的表达

目的在植物毛状根和毕赤酵母中表达人碱性成纤维细胞生长因子(Human basic fibroblast growth factor,hbFGF),并对发酵条件进行优化。方法将hbFGF基因分别克隆至表达载体pCAMBIA1301和pPICZα上,构建重组表达质粒pCAMBIA1301-hbFGF和pPICZα-hbFGF。通过发根农杆菌介导,将pCAMBIA1301-hbFGF质粒转入大豆毛状根;采用电转化法将质粒pPICZα-hbFGF转入毕赤酵母X-33菌株,PCR法筛选阳性转化子,诱导表达。筛选高效稳定表达株,发酵培养并优化发酵条件,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并进行纯化。结果经酶切及测序证明两个重组表达质粒构建正确;经PCR鉴定证明hbFGF基因已整合入大豆毛状根及毕赤酵母基因组中;筛选出了在两种体系中发酵培养的最佳条件;hbFGF在大豆毛状根和毕赤酵母中的表达量分别占总蛋白的31%和42%,且均具有良好的反应原性;经纯化后,均可见相对分子质量约18000的单一条带。结论 hbFGF能够在大豆毛状根和毕赤酵母中高效表达,为其大规模工业化生产奠定了实验基础。     

两种脂质体制备方法对碱性成纤维细胞生长因子活性的影响

目的考察两种脂质体制备方法对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)活性的影响。方法采用薄膜分散法和冻干重建法制备bFGF脂质体,MTT法检测两种方法制备的脂质体中bFGF的活性。结果薄膜分散法和冻干重建法制备的bFGF脂质体活性分别为1·99×107和1·94×107IU/ml。与对照bFGF水溶液相比,两种脂质体制备方法均未降低bFGF活性,且包封率与粒径差异无显著意义。结论采用薄膜分散法和冻干重建法制备bFGF脂质体,对其活性均无影响。     

重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子在CHO-K1-SFS细胞中的表达

目的构建小鼠碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF,亦称FGF-2)的真核表达质粒,并于无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞中进行表达。方法以小鼠垂体组织总RNA为模板,PCR扩增b FGF基因,并克隆至真核表达载体p EGFP-C1,构建重组表达质粒p EGFP-C1-b FGF,经Lipofectamine 2000介导转染无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞,荧光显微镜观察CHO-K1-SFS细胞中EGFP的表达情况,普通光学显微镜观察CHO-K1-SFS细胞的生长状况和细胞形态,RT-PCR法检测CHO-K1-SFS细胞中b FGF基因的转录,Western blot法检测CHOK1-SFS细胞中b FGF蛋白的表达。结果重组表达质粒p EGFP-C1-b FGF经双酶切(BglⅡ/SalⅠ)鉴定证明构建正确;重组质粒p EGFP-C1-b FGF转染后24、48、72及96 h的CHO-K1-SFS细胞均可见特异性绿色荧光蛋白表达,重组质粒p EGFP-C1-b FGF转染对CHO-K1-SFS细胞形态和增殖速率不产生影响;p EGFP-C1-b FGF转染组CHO-K1-SFS细胞可扩增出510 bp的目的条带;p EGFP-C1-b FGF转染组可见相对分子质量约44 000的特异性条带,表达产物可与兔抗b FGF多克隆抗体发生特异性结合。结论构建的真核表达质粒p EGFP-C1-b FGF在无血清悬浮培养的CHO-K1-SFS细胞中成功的表达,为进一步实现小鼠b FGF在哺乳动物细胞中的分泌表达及药物开发奠定了基础。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵及表达产物的纯化

目的 研究重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵和表达产物的纯化工艺。方法采用最适基质浓度、pH、溶氧量、培养温度等发酵表达条件及产物提纯方法。结果 菌体密度A6000达40.8,表达量达160mg/L。提纯的bFGF回收率为40％,生物学活性（ED50）为 0.21ng/mL,比活性达4.76×106U/mg,其纯度、分子量、残余DNA等各项检测结果均符合“重组 DNA制品质量控制要点”。结论 为hbFGF工业化生产和临床应用提供了依据。     

重组碱性成纤维细胞生长因子凝胶剂的制备

目的制备重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)凝胶剂。方法以卡波姆940、甘油、1,2丙二醇为基质,加入复方保护剂(肝素钠、人血白蛋白、甘露醇和HP-β-CD),制成bFGF凝胶剂,观察25和4℃保存的稳定性,并进行家兔局部刺激试验、急性毒性试验、促烧伤创面愈合试验。结果bFGF凝胶剂在25℃保存18个月、4℃保存24个月,效价维持在原效价的80%以上;局部用药未见皮肤刺激反应和急性毒性反应;促家兔烧伤创面愈合的效果明显优于水溶液剂。结论制备的bFGF凝胶剂安全有效,具有缓释作用,稳定性良好,具有广阔的临床应用前景。     

重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗口腔溃疡42例

目的研究重组牛碱性成纤维细胞生长因子对口腔溃疡的治疗效果。方法把84例口腔溃疡患者随机分成两组,治疗组42例,用重组牛碱性成纤维细胞生长因子局部喷洒口腔溃疡创面;对照组42例,采用常规治疗方法。结果治疗组4d有效率为97.6%,对照组4d有效率为78.6%,有显著性差异(P<0.05)。结论重组牛碱性成纤维细胞生长因子对口腔溃疡的治疗具有显著疗效。     

人重组酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌中的表达及鉴定

利用逆转录-DNA聚合酶链式反应，从体外传代培养的人肺成纤维细胞中钓出人酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）全编码区的cDNA，将其克隆人pKK223-质粒，在大肠杆菌JM105中高效表达出人重组aFGF。此aFGF经Heparin－Sepharose纯化后，表现了很好的生物学活性。     

重组牛碱性成纤维细胞生长因子治疗Ⅱ度烧伤的临床疗效

目的 观察重组牛碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对烧伤创面愈合的治疗作用。方法 选择浅Ⅱ度和深Ⅱ度烧伤病例共920例,分别用bFGF治疗其烧伤创面,用药剂量为144U/cm2观察伤后8d（浅Ⅱ度）和15d（深Ⅱ度）创面愈合率,以及创面完全愈合时间。结集8d愈合率总体治疗组为77.6％±24.4％,对照组为51.7％±26.4％;完全愈合时间总体治疗组为9.6±2.4d,对照组为12.6±2.9d。15d愈合率总体治疗组为75.2％±26.3％,对照组为53.3％±25.4％;完全愈合时间总体治疗组为17.5 ±4.5d,对照组为21.9±5.5d。结论 bFGF具有明显的促进Ⅱ度烧伤创面愈合的作用。     

密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达密码子优化的人成纤维细胞生长因子-21(hFGF-21),为探讨hFGF-21在糖尿病治疗方面的作用奠定基础。方法经密码子优化合成hFGF-21基因,构建表达载体pPICZαA-hFGF-21,电转化毕赤酵母GS115,斑点免疫印迹法筛选工程菌株,甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,并对诱导条件进行优化。结果重组表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确。筛选出5株阳性菌株,诱导上清经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约为25000的目的蛋白条带,目的蛋白的表达量约为6μg/L。Westernblot显示该蛋白具有良好的反应原性。诱导96h和培养液pH值为4.0时,目的蛋白的表达量最高,甲醇浓度对表达量无影响。结论已成功构建了密码子优化的hFGF-21真核表达载体,并在毕赤酵母GS115中分泌表达了hFGF-21。     

成纤维细胞生长因子及其受体抑制剂的研究进展

成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）是受体酪氨酸激酶（RTKs）超家族的一员,它可以与成纤维细胞生长因子（FGFs）结合,引发靶细胞的多种反应,同时参与许多生物过程,如细胞增殖、抗凋亡及血管生成等,发挥其生理功能。FGFRs分别在癌细胞和内皮细胞中参与肿瘤的发生和血管的生成,因此,FGFRs-靶向药物会产生直接或间接的抗癌作用。简单介绍了FGFs及FGFRs,重点对FGFR抑制剂的研究进展进行了综述。     

碱性成纤维生长因子对皮肤损伤修复作用的研究进展

皮肤损伤是临床常见疾病之一,大多由撕裂、割伤或挫伤等急性创伤导致。在皮肤损伤修复过程中,多种细胞通过分泌细胞因子参与创面愈合,如碱性成纤维生长因子(fibroblast growth factor 2,FGF2或bFGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)和转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等,其中FGF2可通过促进血管生成、肉芽形成,减少瘢痕形成,加速上皮化促进伤口愈合。FGF2半衰期短,在体内易受酶和皮肤微环境的影响,在伤口处保留时间短暂,降低了其促进伤口愈合的能力,因此,FGF2的稳定性对其临床用于皮肤损伤修复尤为重要。本文就FGF2的分子结构及功能、FGF2受体激活的信号转导途径、FGF2在伤口愈合方面的作用机制及其在整形方面的应用作一综述。     

重组DT/bFGF融合蛋白基因表达载体的构建及表达产物的纯化

目的构建重组DT/bFGF融合蛋白表达载体,制备高纯度的DLF融合毒素。方法PCR扩增DT389和bFGF的编码DNA序列,经酶切和连接,克隆至表达载体pET-30a,转化E.coliBL21(DE3),鉴定阳性克隆菌落,经IPTG诱导表达融合蛋白DLF,镍离子螯合层析纯化,用Westernblot分析其抗原性。结果测序表明,插入片段可编码含545个氨基酸残基的融合蛋白DLF。SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白可在大肠杆菌中表达,其表达量约占菌体总蛋白的20%,表达形式主要为包涵体。纯化后纯度达90%以上。Westernblot证实,该融合蛋白同时具有DT和bFGF两种抗原性。结论已成功构建DT/bF-GF表达载体,并获得较纯的DLF融合毒素。     

Anti-angiogenic effect of an insertional fusion protein of human basic fibroblast growth factor and ribonuclease-1

Human pancreatic ribonuclease-1 (RNase1) does not exhibit its cytotoxicity unless it is artificially internalized into the cytosol. Furthermore, once it encounters the cytosolic RNase inhibitor (RI), the activity of RNase1 is seriously reduced. To achieve the cellular targeting of RNase1 and the blocking of RI binding simultaneously, the basic fibroblast growth factor (bFGF) sequence was inserted into RNase1 at the RI binding site using a gene fusion technique. The effect of this fusion protein, CL-RFN89, on the angiogenesis, which was accelerated by FGF-FGF receptor interaction, was investigated. It was shown by using fluorescein-labeled CL-RFN89, that the binding to human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was dependent on the existence of the FGF receptors. In addition, CL-RFN89 inhibited the cellular growth of HUVECs in vitro and also inhibited the tube formation, using a three-dimensional tube formation assay. Furthermore, this fusion protein was shown to prevent in vivo tumor cell-induced angiogenesis, using the mouse dorsal air sac assay. These results demonstrated that CL-RFN89 inhibits angiogenesis in vitro and in vivo and that it can be expected to be a potent antiangiogenic agent.     

人血管内皮生长因子受体-Fc在DG44细胞中的表达及其生物活性

目的在中国仓鼠卵巢细胞DG44中表达人血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)-Fc,并检测其生物活性。方法化学合成人VEGFR1的第2免疫球蛋白结构域(VEGFR1D2)基因和人VEGFR2的第3免疫球蛋白结构域(VEGFR2D3)基因,通过重叠PCR(Overlap PCR)将VEGFR1D2-VEGFR2D3和人IgG1Fc拼接形成VEGFR-Fc融合基因,插入真核表达载体pD2中,构建重组表达质粒pD2-VEGFR-Fc,在FreeStyleTMMAX Reagent和OptiPROTMSFM介导下转染至DG44细胞中,MTX加压筛选稳定表达VEGFR-Fc蛋白的细胞株,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法检测细胞培养上清中VEGFR-Fc蛋白的表达。表达的VEGFR-Fc蛋白经HiTrapTMProteinA FF柱纯化后,利用显微镜观察法和血管内皮细胞ECV304模型检测其生物活性。结果 VEGFR-Fc基因扩增产物大小为1 377 bp;重组表达质粒pD2-VEGFR-Fc经双酶切和测序证明构建正确;质粒pD2-VEGFR-Fc转染的DG44细胞培养上清中含VEGFR-Fc蛋白,表达量为0.5 g/L;细胞培养上清经HiTrapTMProteinA FF柱纯化后,杂蛋白去除效果较好;纯化的VEGFR-Fc能与VEGF特异性结合,抑制ECV304生长。结论成功在DG44细胞中表达了具有生物活性的VEGFR-Fc,为进一步研究其在抑制血管生成和抗肿瘤中的作用奠定了基础。     

Inhibition of cell growth by a fused protein of human ribonuclease 1 and human basic fibroblast growth factor

Pancreatic-type RNases are considered to have cytotoxic potentialdue to their ability to degrade RNA molecules when they enterthe cytosol. However, most of these RNases show little cytotoxicitybecause cells have no active uptake mechanism for these RNasesand because the ubiquitous cytoplasmic RNase inhibitor is consideredto play a protective role against the endocytotic leak of RNasesfrom the outside of cells. To study the cytotoxic potentialof RNase toward malignant cells targeting growth factor receptors,the C-terminus of human RNase 1 was fused to the N-terminusof human basic fibroblast growth factor (bFGF). This RNase–FGFfused protein effectively inhibited the growth of mouse melanomacell line B16/BL6 with high levels of cell surface FGF receptor.This effect appeared to result from prolongation of the overallcell cycle rather than the killing of cells or specific arrestin a particular phase of the cell cycle. Thus, human RNase 1fused to a ligand of cell surface molecules, such as the FGFreceptor, is shown to be an effective candidate for a selectivecell targeting agent with low toxic effects on normal cell types.     

川芎嗪对雪旺细胞神经生长因子合成与分泌的影响

目的观察川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)对雪旺细胞(Schwann cells,SCs)合成与分泌神经生长因子(Nervegrowth factor,NGF)的影响,探讨其促进周围神经损伤修复的可能机制。方法采用DMSO溶解TMP,将SCs分为正常对照、溶媒对照组和不同浓度TMP组(终浓度分为25、50、100和200μg/ml),作用24 h后,通过MTT法和流式细胞术分析TMP对SCs增殖和凋亡的影响,Real-Time PCR与ELISA法分别检测TMP在mRNA和蛋白质水平对SCs合成与分泌NGF的影响。结果 TMP对SCs的增殖活力及凋亡均无影响。溶媒对照组、25、50μg/ml TMP组NGF基因mRNA水平和细胞培养上清中NGF含量与正常对照组相比,差异均无统计学意义(P>0.05);100、200μg/ml TMP组与正常对照组相比明显增高(P<0.05),两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TMP可促进SCs合成与分泌NGF,且该作用具有浓度依赖性,这可能是其促进神经损伤修复的机制之一。     

乳癌组织中人类表皮生长因子受体2蛋白的纯化及鉴定

目的建立乳腺癌组织中人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)蛋白的纯化方法。方法采用新鲜的乳腺癌组织制备匀浆液,经60%饱和硫酸铵盐析沉淀法进行乳腺癌组织蛋白的粗提;再通过DEAE-Sephadex A-50离子交换层析和两次Sephacryl S-200分子筛层析进一步纯化HER2蛋白;纯化蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果纯化后HER2蛋白相对分子质量为185 000;HER2蛋白可与兔抗人HER2多克隆抗体发生特异性结合。结论建立的纯化方法获得了具有免疫学活性的HER2蛋白,为HER2单克隆抗体的制备奠定了基础。