人膜联蛋白A3的原核表达及纯化

目的 原核表达人膜联蛋白(annexin,ANX)A3(ANX A3),并进行纯化。方法 提取人胎盘样品总RNA,反转录建立c DNA文库,用KOD-Plus高保真DNA聚合酶扩增anx A3基因编码区全长,连接至克隆载体p EASY-Blunt上,测序鉴定。用primix extaq酶重新扩增anx A3基因,与表达载体p EASY-E1连接,构建重组表达质粒p EASY-anx A3,转化E.coli Transetta DE3,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经6×His纯化介质及Bio-Rad Bio Logic Duo Flow Chromatography Systems纯化后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果 重组表达质粒经菌落PCR鉴定,阳性克隆可扩增出972 bp的目的片段,与NCBI中Gen Bank上报道的anx A3序列完全一致。纯化的重组蛋白相对分子质量约为36 000,可与鼠Anti 6×His-Tag单克隆抗体特异性结合,浓度为400μg/ml。结论 成功构建了重组原核表达质粒p EASY-anx A3,并在E.coli Transetta DE3中表达了重组蛋白,为进一步研究ANX A3在哮喘病的起因和形成中的作用及机制奠定了基础。     

人内源性博尔纳样核蛋白-1的原核表达及纯化

目的原核表达人内源性博尔纳样核蛋白-1(endogenous Borna-like N element-1,EBLN-1),并进行纯化及鉴定。方法以人工合成的EBLN-1基因为模板,PCR扩增EBLN-1基因,克隆至载体pET-41a中,构建重组表达质粒pET-41aEBLN-1,转化大肠埃希菌BL21(DE3)和Rosetta中,分别于18℃和37℃下进行IPTG诱导表达。采用包涵体稀释复性法对表达蛋白进行复性,经His亲和层析纯化后,SDS-GAGE和Western blot法鉴定纯化产物。结果重组表达质粒pET-41a-EBLN-1经菌落PCR及测序鉴定构建正确。重组表达蛋白相对分子质量约48 000,以包涵体形式表达。在大肠埃希菌Rosetta中37℃诱导时表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上,纯化后蛋白纯度可达90%,可与HRP标记的His探针特异性结合。结论成功表达并纯化了重组EBLN-1蛋白,为后续深入研究EBLN-1在人体中的生理作用及其与精神疾病的相关性奠定了基础。     

人心肌肌酸激酶MB同工酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化人心肌肌酸激酶MB同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)。方法分别从含CK-M、CK-B基因片段的质粒SC319293和SC119007中扩增CK-M、CK-B基因,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,经GST亲和层析柱纯化后,ELISA法检测其抗原性。结果重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB经菌落PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组CK-MB蛋白相对分子质量约110 000,表达量占菌体总蛋白的57%,主要以包涵体形式存在;纯化的CK-MB蛋白纯度大于90%,可与兔抗CK-B、CK-M多克隆抗体特异性结合。结论成功原核表达并纯化了重组CK-MB蛋白,为其大量生产奠定了基础。     

NIRF蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达NIRF基因,并纯化NIRF蛋白。方法 PCR扩增全长NIRF基因,克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,并用GST 4B球珠亲和纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pGST-NIRF经酶切鉴定证明构建正确。22℃条件下培养,菌体A600值达1.8时,加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导7 h,能使GST-NIRF在上清中大量表达;纯化的重组GST-NIRF蛋白纯度达85%以上,可与GST抗体和NIRF抗体发生特异性结合。结论已成功在大肠杆菌中表达了GST-NIRF蛋白,纯化的蛋白可用于NIRF的生物功能活性研究。     

翻译调控肿瘤蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化翻译调控肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein,TCTP)。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7总RNA为模板,PCR扩增TCTP基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。His Trap FF层析柱纯化重组蛋白后,进行Western blot鉴定。结果克隆的目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为20 000,主要以包涵体形式表达;纯化后纯度为80%,可与兔抗人TCTP多克隆抗体特异性结合。结论已成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化了TCTP,为进一步研究其在肿瘤等疾病发生、发展及治疗中的作用奠定了基础。     

钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)。方法利用PCR技术扩增钝顶螺旋藻sod基因,克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-sod,转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白SOD-GST利用蛋白纯化树脂Glutathione SepharoseTM4 Fast Flow纯化后,采用改进的邻苯三酚自氧化法测定重组SOD的活性。结果重组表达质粒pGEX-4T-sod经双酶切和测序证实构建正确;表达的融合蛋白SOD-GST的相对分子质量约为49 000,表达量占菌体总蛋白的30.2%,在重组菌裂解上清和沉淀中均有融合蛋白的表达;纯化的融合蛋白纯度为82.4%,浓度为2.8 mg/ml,从可溶性表达产物中纯化的酶的比活性为1 440 U/mg。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化了具有生物学活性的钝顶螺旋藻SOD,为其产业化生产奠定了基础。     

人重组催乳素蛋白的原核表达、纯化及其稳定性分析

目的 表达并纯化重组人催乳素(prolactin,PRL)蛋白,并检测其抗原性及稳定性。方法 以商品化的PRL c DNA为模板,PCR扩增目的基因,定向克隆至质粒p ET25中,构建重组原核表达质粒PRL-p ET25b,转化大肠埃希菌后诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化,SDS-PAGE鉴定后,采用Bradford法测定蛋白浓度,PRL定量试剂盒分析抗原性,置-20、4和37℃9 d后,分析稳定性。结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组PRL蛋白相对分子质量约30 000,以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的15%,纯度大于90%,总蛋白浓度为0.796 mg/ml。重组PRL蛋白于-20、4和37℃放置9 d,浓度变化较小,偏差在10%以内。结论 获得了高纯度的重组PRL融合蛋白,抗原性及稳定性均较好,可应用于试剂盒标准品或校准品的制备。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal entertoxin B,SEB)。方法以合成的SEB全基因序列为模板,PCR扩增SEB基因片段,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-SEB,转化E.coil BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经硫酸铵盐析、SP阳离子层析柱、Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱纯化后,用Thrombin切除组氨酸标签,再经Chelating金属鳌合层析铜(Cu2+)柱和DEAE阴离子层析柱纯化。结果重组原核表达质粒pET-28a-SEB经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为31 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%。最终纯化后的重组SEB蛋白纯度可达90%以上。结论成功构建了SEB基因重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了重组SEB蛋白,为进一步研究其致病机理及防控方法奠定了基础。     

重组EB病毒Zta蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达重组EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)Zta蛋白,并进行纯化。方法 PCR扩增EBV B95-8株BZLF1n氨基端基因,分别插入pThioHisA和pcDNA3.1载体中,构建重组表达质粒pThioHisA-BZLF1n和pcDNA3.1-BZLF1n。用pcDNA3.1-BZLF1n质粒免疫ICR小鼠,制备抗血清。将质粒pThioHisA-BZLF1n转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,优化诱导表达条件。表达产物经亲和层析后,用肠激酶切割,再经离子交换层析,纯化产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重组表达质粒经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组蛋白相对分子质量约为32 000;IPTG终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导6 h,目的蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的30%以上;重组蛋白以包涵体和可溶性两种形式表达。纯化的重组蛋白相对分子质量约为18 000,纯度大于95%,可与制备的小鼠抗血清发生特异性反应。结论在大肠杆菌中高效表达了重组EBV Zta蛋白,纯化的重组蛋白纯度较高,特异性良好,为EBV相关疾病的早期诊断筛查奠定了基础。     

结核分枝杆菌PPE68蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌PPE68基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增PPE68基因,将其克隆至pET-32a(+)载体中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定后,进行纯化。结果重组表达质粒pET-32a(+)-PPE68经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE68基因序列一致。表达的Trx-PPE68融合蛋白相对分子质量约为57000,表达量约占菌体总蛋白的41%,可与结核分枝杆菌免疫小鼠血清发生特异性反应。纯化的重组蛋白纯度约为93%。结论已成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPE68,原核表达并纯化了重组蛋白,为PPE68作为结核病特异性诊断抗原的开发及重组BCG疫苗的研制奠定了基础。     

单增李斯特菌溶血素O的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化单增李斯特菌溶血素O(Listeriolysin O,LLO)。方法 PCR扩增LLO hly基因,并插入pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-hly,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,切胶纯化重组蛋白,并进行Westernblot分析。结果克隆的hly基因长1 515 bp,与GenBank中登录的hly基因的核苷酸序列同源性为99%;重组表达质粒pET-hly经酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为55 000,表达量占细菌总蛋白的45.2%;纯化的重组蛋白可与单增李斯特菌阳性血清反应。结论已成功原核表达并纯化了LLO,为下一步诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

B型肉毒毒素轻链蛋白的原核表达及纯化

目的克隆B型肉毒毒素轻链Bont-B基因,使其在大肠杆菌内表达,并对表达的重组蛋白进行纯化。方法设计并人工合成Bont-B基因,克隆入表达载体pMD19-T中,构建质粒pMD19-T-Bont-B,经酶切后与pET-28a载体连接,构建重组表达质粒pET-28a-Bont-B,将重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE及Western blot分析后,经金属螯合层析Cu2+柱进行纯化,纯化产物经SDS-PAGE分析纯度。结果重组表达质粒pET-28a-Bont-B经PCR、双酶切及测序鉴定,证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约50 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的6%;纯化后的重组蛋白纯度可达90%以上。结论已成功克隆并在大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达了Bont-B轻链基因,为制备抗Bont-B轻链单克隆抗体及研究肉毒中毒机制和治疗奠定了基础。     

鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)VP3蛋白。方法将GPV VP3基因重组表达质粒pGEX-6P-VP3转化入大肠杆菌BL21(DE3)plysS内,IPTG诱导表达;用Sepharose 4B(Prepacked Glutathion)亲合层析柱纯化可溶性和不溶性包涵体蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot及Dot-ELISA鉴定。结果表达的GST/VP3融合蛋白相对分子质量为85 000,主要以不溶性包涵体形式存在;纯化的可溶性蛋白和包涵体蛋白含量分别为2.20和3.30 mg/ml;纯化的GST/VP3融合蛋白能被鹅抗GPV多克隆抗体特异性识别。结论原核表达并纯化了GPV VP3蛋白,为进一步研究其功能和免疫学特性及研制基因工程亚单位疫苗和新型抗原制剂奠定了基础。     

日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化日本血吸虫亮氨酸氨基肽酶(Leucine aminopeptidase of Schistosoma japonicum,SjLAP)。方法从日本血吸虫成虫中RT-PCR扩增LAP基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组SjLAP蛋白(rSjLAP)经SDS-PAGE和Western blot分析后,经His Binding Purification Kit层析纯化,纯化的rSjLAP蛋白经SDS-PAGE分析纯度,Bradford法测定浓度。结果克隆的SjLAP基因与GenBank中登录的基因序列比较有2个碱基发生置换,导致对应的2个氨基酸发生置换,但均不在关键区域;重组表达质粒pET-28a/SjLAP经双酶切鉴定证实构建正确;表达的rSjLAP蛋白相对分子质量约45 000,诱导4 h表达量最高;纯化的rSjLAP蛋白纯度较高,浓度达5.0 mg/ml,并可被抗小鼠His-tag单抗及血吸虫感染的患者血清和兔血清特异性识别,具有良好的反应原性。结论成功在大肠杆菌中表达了rSjLAP蛋白,纯化的rSjLAP纯度较高,为血吸虫病的诊断和预防等研究奠定了基础。     

牛种布鲁菌VirB12蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化牛种布鲁菌(Brucella)VirB12蛋白。方法利用PCR法从牛种布鲁菌基因组中扩增VirB12基因,插入pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pETV12,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经组氨酸结合树脂柱纯化后,进行SDS-PAGE及Western blot分析。结果重组表达质粒pETV12经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约22 000,纯化的重组蛋白纯度达94%,可被布鲁菌免疫兔血清特异性识别。结论原核表达并纯化了牛种布鲁菌VirB12蛋白,为进一步研究VirB12蛋白的结构、功能及相关疫苗的研制奠定了基础。