血管紧张素转化酶基因多态性与特发性肺纤维化相关性

目的探讨血管紧张素转化酶(ACE)基因多态性与特发性肺纤维化(IPF)患者的相关性;监测IPF患者血浆中血管紧张素转化酶(ACE)活性、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平的变化。方法应用PCR技术扩增ACE基因目的片段检测基因多态性;采用紫外吸收法测定ACE酶的活性;采用竞争放射免疫分析法测定AngⅡ水平。结果(1)IPF患者与正常对照组的D等位基因频率及DD基因型分布有显著性差异(P<0.05)。(2)IPF患者与正常对照组的血浆ACE活性与AngⅡ水平有显著性差异(P<0.05)。结论(1)ACE基因I/D多态性与IPF发病有关,DD基因型是肺纤维化发病的危险因素。(2)血循环中ACE活性和AngⅡ水平升高与肺纤维化病变有关,两者可以促进肺纤维化的发生、发展。     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压的相关性

目的研究血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因A1675G多态性与山东济宁地区汉族女性原发性高血压(EH)的相关性。方法随机选取山东省济宁地区汉族女性EH患者127例(EH组)和体检正常的女性119例(正常对照组),提取外周血基因组DNA,PCR扩增A1675G基因,高分辨率熔解(HRM)法测定A1675G基因的多态性。结果EH组AA、AG和GG基因型频率(分别为26.8%、53.5%和19.7%)与正常对照组(分别为27.7%、42.0%和30.3%)比较,差异均无统计学意义;等位基因频率(A:53.5%;G:46.5%)与正常对照组(A:48.7%;G:51.3%)比较,差异也无统计学意义。结论A1675G基因多态性可能与山东省济宁地区汉族女性原发性高血压无明显相关性。     

血管紧张素Ⅱ受体AT1拮抗剂降血压药物的临床进展及合成

介绍了肾素－－－血管紧张素系统（ＲＡＳ）及血管紧张素Ⅱ受体（ＡＴ１）拮抗剂的作用机理,描述了近年上市的５个本类降血压药物（洛沙坦钾、伐尔沙坦、坎得沙坦、依贝沙坦和依普沙坦）的临床进展及合成,同时也介绍了可望很快上市的３个新药（他素沙坦、替米沙坦和ＣＳ－８６６）的合成。     

血管紧张素(-1-7)对血管紧张素Ⅱ在大鼠心脏成纤维细胞中信号转导的影响及其机制

目的探讨血管紧张素(-1-7)[Angiotensin(-1-7),Ang(-1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)在大鼠心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)中信号转导的影响及其机制。方法原代分离培养并鉴定新生SD大鼠的CFs,将细胞分为8组:空白对照组、AngⅡ组、Ang(-1-7)组、AngⅡ+Ang(-1-7)组、AngⅡ+Ang(-1-7)+A-779组、AngⅡ+Ang(-1-7)+PAO组、Ang(-1-7)+PAO组和AngⅡ+PAO组,Western blot法检测细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)和磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)的表达;免疫沉淀捕捉分析法检测蛋白酪氨酸磷酸酶-1(Src-homology domain 2 containing protein tyrosine phosphatase-1,SHP-1)的酶活性;实时荧光定量PCR检测转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、I型胶原蛋白(CollagenⅠ,ColⅠ)和Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ,ColⅢ)基因mRNA的转录水平。结果 AngⅡ可增加细胞内p-ERK1/2的表达水平和p-ERK/ERK值(磷酸化的p-ERK1/2与总的ERK1/2的比值),Ang(-1-7)通过与Mas受体结合可拮抗AngⅡ引起的上述效应;Ang(-1-7)通过与Mas受体结合而激活胞内SHP-1的活性,并可拮抗AngⅡ所致的SHP-1活性降低;抑制SHP-1的活性后,Ang(-1-7)拮抗AngⅡ诱导的p-ERK1/2表达水平和p-ERK/ERK值增高的效应被抑制。Ang(-1-7)对TGF-β1、ColⅠ和ColⅢ基因mRNA的转录水平无显著影响,但可抑制AngⅡ所诱导的上述基因mRNA转录水平的增加。结论 Ang(-1-7)通过与Mas受体结合而激活SHP-1,该效应与Ang(-1-7)拮抗AngⅡ诱导的p-ERK1/2的表达水平和p-ERK/ERK值增高密切相关;Ang(-1-7)可抑制AngⅡ所诱导的TGF-β1、ColⅠ和ColⅢ基因表达上调,这些现象可能体现了一种Ang(-1-7)拮抗AngⅡ所致的不良效应的保护性机制。     

血管紧张素Ⅰ的固相合成

以Fmoc-Leu-wang树脂为载体,根据Fmoc方法化学合成血管紧张素Ⅰ（AⅠ）。粗肽经RP-HPLC分离后用电喷雾质要法测其相对分子质量。结果表明,反相主峰明显,杂质少,电喷雾质谱测得的m／z 1296．8与AⅠ的[M＋H]^＋离子理论值（1297）相符。试剂除杂处理很重要,操作技术的改进使方法更实用。     

血管紧张素转换酶抑制剂致老年高血压高钾血症10例

血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)治疗老年高血压病合并有轻度肾功能不全,有10例患者发生高血钾症的副作用。     

血管紧张素转换酶基因rs4340和rs4343多态性与心房颤动的相关性

目的探讨血管紧张素转换酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)基因rs4340和rs4343多态性与心房颤动(简称房颤)的相关性。方法选择重庆地区4家三甲医院就诊的102例房颤患者及同期住院的无房颤病史患者100例,抽取患者静脉血,分别提取基因组DNA,采用单核苷酸多态性-限制性片段长度多态性(Single nucleotide polymorphism,restriction fragmentlength polymorphism,SNP-RFLP)法及基因测序检测ACE基因rs4340和rs4343的基因型。结果房颤组ACE基因rs4340多态性的基因型及等位基因分布与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05),房颤组rs4343的基因型和等位基因分布与对照组间差异有统计学意义(P<0.001或P=0.001)。与对照组相比,房颤组GG+AG基因型频率明显高于AA基因型频率(P<0.001)。II/AA基因型在房颤组中出现的频率明显少于对照组(P=0.001),而II/AG基因型在房颤组中出现的频率明显高于对照组(P=0.002)。房颤组中rs4340和rs4343各基因型左房前后径与右房横径差异均无统计学意义(P>0.05);而将两位点联合分析发现,携带II/AA基因型房颤患者的左房前后径和右房横径均明显小于其他基因型(P<0.001),同时,携带II/AG基因型房颤患者的左房前后径和右房横径均明显大于其他基因型(P<0.001)。结论 ACE基因rs4343多态性与房颤显著相关,II/AA基因型是房颤发生发展的保护因子,而II/AG基因型是预测房颤发生发展的危险因子。     

藁本内酯对血管紧张素Ⅱ诱导损伤的人脐静脉内皮细胞中miR-122表达的影响及其作用机制

目的 探讨藁本内酯对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中miR-122表达的影响及其作用机制.方法 将HUVECs随机分为6组:空白组(不给药)、模型组(1×10-5 mol/L AngⅡ...     

血管紧张素转化酶抑制剂阿拉普利的合成研究

研究了血管紧张素转化酶抑制剂阿拉普利(Alacepril)的合成新方法,以硫代乙酸、2-甲基丙烯酸为原料经过1,4-亲核加成、氯化、氨解、成盐、酯化、水解等反应合成了阿拉普利,总收率为18%。在该合成工艺中,未将L-脯氨酸的氨基进行保护,使反应步骤更简便,更适宜工业化。     

磁性琼脂糖微球固定化血管紧张素转化酶的制备及性质

采用反相悬浮包埋法制备磁性琼脂糖微球,然后以环氧氯丙烷为活化剂固定血管紧张素转化酶(ACE)。探讨了ACE固定化的影响因素,确定了固定化最适条件：酶溶液蛋白质量浓度为8g/L,pH为7.8,温度为50℃,固定化时间为2h,所得的固定化酶的活力达到0.128U/g;对磁性固定化ACE的性质进行了研究,固定化ACE最适温度为42℃ ,最适pH为8.3。同时,比较了磁性固定化与游离ACE对pH的耐受力和热稳定性,在 pH =5 的缓冲液中放置1h后,固定化ACE和游离ACE酶活力保留率分别为62.1%和40.7%,当pH= 9,两者酶活力保留率分别为95.7%和89.2%;60℃时,两者酶活力保留率分别为50.2%和20.7%;-20℃储存30d后, 两者酶活力保留率分别为90.3%和43.0%;连续操作10次后,固定化ACE活力仍保持53.0%。研究表明,磁性固定化ACE在外加磁场的作用下可快速重复回收利用,具有良好的应用前景。     

磁性琼脂糖微球固定化血管紧张素转化酶的制备及性质

采用反相悬浮包埋法制备磁性琼脂糖微球,然后以环氧氯丙烷为活化剂固定血管紧张素转化酶(ACE)。探讨了ACE固定化的影响因素,确定了固定化最适条件:酶溶液蛋白质量浓度为8 g/L,p H=7.8,温度为50℃,固定化时间为2 h,所得的固定化酶的活力达到0.128 U/g;对磁性固定化ACE的性质进行了研究,固定化ACE最适温度为42℃,最适p H=8.3。同时,比较了磁性固定化与游离ACE对p H的耐受力和热稳定性,在p H=5的缓冲液中放置1 h后,固定化ACE和游离ACE酶活力保留率分别为62.1%和40.7%,当p H=9,两者酶活力保留率分别为95.7%和89.2%;60℃时,两者酶活力保留率分别为50.2%和20.7%;-20℃储存30 d后,两者酶活力保留率分别为90.3%和43.0%;连续操作10次后,固定化ACE活力仍保持53.0%。研究表明,磁性固定化ACE在外加磁场的作用下可快速重复回收利用,具有良好的应用前景。     

昆虫细胞-杆状病毒表达系统的研究进展

杆状病毒是节肢动物特异的DNA病毒,具有双链环状结构,基因排列紧凑,最初因为其高度的特异性,在病虫害防治方面起到了重要作用。1983年人类首次构建杆状病毒载体并成功表达了β-干扰素蛋白,此后,杆状病毒表达载体(baculovirus expression vector,BEV)系统在生产重组病毒、表达重组蛋白、提高重组蛋白稳定性、产量及翻译后修饰等方面不断优化,昆虫细胞-BEV系统成为四大常用表达系统之一。本文主要介绍BEV系统优化最新方法和关键要素。     

共表达流感病毒基质蛋白1和基质蛋白2基因的重组杆状病毒的构建

目的构建共表达流感病毒基质蛋白1(matrix protein 1,M1)和基质蛋白2(M2)基因的重组杆状病毒。方法扩增流感病毒A/PR/8/34株的M1和M2全长基因,并将其分别插入到p Fast Bacdual(p FBD)载体的两个多克隆位点,筛选出阳性重组转座载体p FBD-M1/M2,将其转化含有穿梭载体Bacimd的感受态DH10Bac细胞,经同源重组获得重组穿梭载体r Bacmid-M1/M2,在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,包装出重组杆状病毒r Bac-M1/M2。采用噬斑形成法检测重组病毒滴度,PCR法检测重组病毒基因组M1和M2基因插入情况,间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot法检测M1和M2基因的表达。结果经PCR鉴定重组穿梭载体r Bacmid-M1/M2构建正确;第3代r Bac-M1/M2滴度为1×108 pfu/ml;感染r Bac-M1/M2的sf9昆虫细胞经PCR扩增,可见3 600 bp的条带;可在感染细胞的胞内和胞膜上检测到明显的特异性黄绿色荧光;感染r Bac-M1/M2的细胞裂解上清与鼠抗流感病毒(PR8株)多克隆抗体发生特异性反应,在相对分子质量约26 000及11 000处可见特异性反应条带。结论成功构建了共表达H1N1亚型流感病毒M1和M2基因的重组杆状病毒,为构建流感病毒样颗粒以及研制新型广谱流感疫苗奠定了基础。     

磁性壳聚糖微球的合成及其在固定化血管紧张素转化酶的应用

以化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子为磁核,采用乳化交联法制备磁性壳聚糖微球,并对其形貌、结构和磁饱和强度等性质进行了表征。以磁性壳聚糖微球作为载体,固定化猪肺粗提物中的血管紧张素转化酶,并对固定化条件进行研究。结果表明,固定化血管紧张素转化酶的最佳条件为：pH值为8.3,最佳温度为50 ℃,最佳时间为1.5 h,最佳酶溶液蛋白浓度为6 mg/mL,此时固定化酶活力最高为0.048 U/g微球。与游离酶相比,固定化酶的pH值稳定性和热稳定性均得到提高。固定化酶重复使用10次,仍然保持40%以上相对活力,说明磁性壳聚糖微球是固定化血管紧张素转化酶的良好载体。     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

人MCIR基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MCIR基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MCIR为模板，利用PCR方法扩增人MCIR基因，将MCIR基因连接到pfastBacl质粒上，与穿梭载体DH10Bac转座，获得Bacmid-MCIR质粒后，通过脂质体介导，转染Sf9细胞，使其表达重组杆状病毒，经SDS-PAGE检测表达产物，放射受体分析法检测目的蛋白MCIR活性。结果Bacmid-MCIR质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱，在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和，具有生物学活性。结论MCIR基因成功在真核细胞中得到表达。     

新型血管紧张素转化酶抑制剂的合成

采用氯乙酰氯与取代甘氨酸酯作用生成 N-氯乙酰基 - N -取代甘氨酸酯 ,该产物在碱存在下与谷氨酸 -α-酯 -γ-酰胺衍生物缩合 ,再脱去末端羧基保护基得到血管紧张素转化酶抑制剂 N- [N- (1-乙氧羰基 - 3-对位取代苯氨甲酰基 )丙基甘氨酰 ]- N-取代甘氨酸类化合物。     

中蜂囊状幼虫病毒VP1基因在杆状病毒表达系统中的表达

目的利用杆状病毒系统表达中蜂囊状幼虫病毒(chinese sacbrood virus,CSBV)结构蛋白VP1基因。方法提取感染CSBV的中蜂囊状幼虫总RNA,RT-PCR法扩增VP1基因,克隆至载体pFastBacI中,构建重组转座质粒pFastBacI-VP1,转化至感受态大肠埃希菌DHl0Bac中,获得重组杆粒rBacmid-VP1,转染至昆虫细胞sf9中,获得第1代重组杆状病毒,经透射电镜观察杆状病毒粒子;病毒连续传代3次后,RT-PCR鉴定重组杆状病毒,SDS-PAGE检测VP1蛋白的表达情况,Western blot检测表达产物的反应原性。结果重组杆粒经PCR鉴定构建正确;第1代重组杆状病毒经透射电镜观察,可见杆状病毒粒子;重组杆状病毒以M13通用引物和VP1基因特异引物进行PCR扩增,分别可见3 263和963 bp的片段,大小均与理论值一致;CSBV VP1基因能够在sf9细胞中表达,表达的重组VP1蛋白相对分子质量约31 000,可与兔抗CSBV-VP1阳性血清发生特异性反应。结论成功利用杆状病毒表达系统表达了CSBV VP1基因,为深入研究CSBV的感染机制和蜜蜂的免疫机制以及中蜂囊状幼虫病血清诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的构建H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,并进行鉴定。方法 PCR扩增H1N1亚型流感病毒(A/PR/8/34)全长M1基因,与pFastBacdua(lpFBD)载体连接,构建重组杆状病毒转移载体pFBD-M1,转化含有Bacimd和Helper质粒的DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-M1,将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-M1。采用噬斑形成法检测病毒滴度,PCR法检测M1基因的插入,间接免疫荧光、Western blot和ELISA法检测M1蛋白的表达。结果重组杆状病毒骨架质粒rBacmid-M1经PCR鉴定证实构建正确;第3代rBac-M1病毒滴度为3×108pfu/ml;感染rBac-M1的sf9细胞经PCR扩增可见3 300 bp的条带,间接免疫荧光检测可见特异性绿色荧光,Western blot检测可与鼠抗流感病毒(PR8)和鼠抗M1蛋白(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,ELISA检测M1蛋白可与鼠抗流感病毒(PR8)多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性。结论已成功构建了H1N1亚型流感病毒M1基因重组杆状病毒,为进一步研究流感病毒M1的功能及新型流感疫苗开发奠定了基础。     

杆状病毒-昆虫细胞技术在人用重组蛋白疫苗生产中的应用

杆状病毒-昆虫细胞表达系统是生物领域四大表达系统之一。近年,随着Cervarix誖、Provenge誖和FluBlok誖的批准上市,杆状病毒-昆虫细胞表达系统的发展也取得了里程碑式的重大突破。同时,随着技术的快速发展,杆状病毒-昆虫细胞技术平台在疫苗研发和生产中的应用日益广泛而深入。本文拟对杆状病毒-昆虫细胞技术的起源、发展及其在人用重组蛋白疫苗生产中的应用作一综述。