Pre-miR-10a重组腺病毒质粒的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建pre-miR-10a(miR-10a前体)重组腺病毒表达质粒,感染K562细胞,并检测其基因表达水平。方法化学合成pre-miR-10a基因序列,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,将构建正确的重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV pre-miR-10a与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183感受态细胞,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,经4轮扩增后检测病毒滴度。收集病毒后,以100 MOI感染K562细胞,RT-PCR法检测miR-10a基因的转录水平。结果重组腺病毒质粒pAd-pre-miR-10a经PacⅠ酶切,证明带有目的基因的重组腺病毒穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中,4轮扩增后腺病毒滴度为1.5×1011pfu/ml,可高效感染K562细胞,感染效率达90%以上;重组腺病毒Ad-pre-miR-10a感染的K562细胞中miR-10a基因转录水平明显升高,过表达率为150.82%。结论已成功构建重组腺病毒表达质粒pAd-pre-miR-10a,并可在K562细胞中高效表达,为进一步从体内和体外水平研究其抗白血病效应奠定了基础。     

表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶的重组腺病毒的构建及其免疫原性

目的构建表达甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的重组腺病毒,并检测其免疫原性。方法从质粒pMD19T-simple-NA中扩增NA基因,克隆至穿梭质粒pShuttleCMV中,经同源重组获得重组腺病毒质粒,转染Ad-293细胞,包装出重组腺病毒Ad-NA,RT-PCR和免疫荧光法检测NA基因在Vero细胞中的转录和表达。CsCl密度梯度离心纯化重组腺病毒,免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠血清中抗NA抗体滴度。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定表明带有目的基因的穿梭质粒已整合到腺病毒基因组中;NA基因在Vero细胞中成功转录和表达;重组腺病毒可刺激小鼠产生抗NA抗体,初免后4周,抗体水平达最高,为1∶100 000。结论成功构建了表达甲型H1N1流感病毒NA蛋白的重组腺病毒,其可刺激小鼠产生有效的免疫应答,为甲型H1N1流感病毒基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

犬细小病毒VP2蛋白重组人5型腺病毒的构建

目的构建犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)VP2蛋白重组人5型腺病毒。方法将从CPV中PCR扩增的VP2基因克隆至穿梭质粒pacAd5 CMVK-NpA中,经酶切及测序鉴定,将构建正确的重组穿梭质粒pacAd5-cVP2与骨架质粒pacAd5 9.2-100经PacⅠ酶切线性化,共转染293AD细胞,进行同源重组,包装出重组腺病毒rAd5v-cVP2,按Karber法计算重组腺病毒的病毒滴度(TCID50)。电镜下观察重组腺病毒的形态;RT-PCR及Western blot法检测CPV VP2基因mRNA的转录及蛋白的表达水平。结果重组穿梭质粒pacAd5-cVP2经酶切及测序证明构建正确;包装出的重组腺病毒rAd5v-cVP2的病毒滴度可稳定在108.25TCID50/ml;电镜下观察可见典型的腺病毒外型特征;重组腺病毒感染的293AD细胞可检测到VP2基因的转录和表达。结论已成功构建了CPV VP2蛋白重组人5型腺病毒。     

重组腺病毒Ad5/F35-HF2S的构建及其鉴定

目的构建携带HA标签的重组腺病毒Ad5F35-HF2S。方法体外合成HA标签DNA双链,以K562细胞cDNA为模板,分别扩增FKBP1、FKBP2和SH2基因,依次亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV-HA中,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S,穿梭质粒经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAd5/F35在Ad5/F35-BJ5183感受态细胞中同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,获得重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,经2轮扩增后,测定病毒滴度;采用PCR及Western blot法检测感染细胞中HF2S基因的转录及蛋白的表达。结果重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-HF2S及重组腺病毒质粒pAd5/F35-HF2S经鉴定均构建正确;经包装及2轮扩增后,重组腺病毒Ad5/F35-HF2S病毒滴度可达1013IU/ml;经PCR及Western blot鉴定表明,重组腺病毒携带的HF2S基因能够在AD-293细胞中表达。结论已成功构建了表达HF2S基因的重组腺病毒Ad5/F35-HF2S,为研究Grb2-SH2结构域在CML中的基因治疗和作用机制奠定了基础。     

Wistar大鼠热休克蛋白70基因重组腺病毒质粒的构建及病毒制备

目的构建Wistar大鼠热休克蛋白(Heat shock protein 70,HSP70)基因重组腺病毒质粒,并制备重组腺病毒。方法利用RT-PCR技术从Wistar大鼠脾脏组织中扩增HSP70基因序列,并克隆至pMD18-T载体中,测序鉴定后,将克隆的HSP70基因编码阅读框亚克隆至穿梭载体pShuttle-CMV中,并利用Ⅰ-CeuⅠ与Ⅰ-SceⅠ将重组穿梭质粒上的HSP70基因的表达框切下,连接到携带腺病毒骨架载体pAdxsi上。重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切线性化后,转染至293(R)细胞进行病毒的包装,获得重组腺病毒pAd-CMV-HSP70,收集病毒上清,感染BRL细胞,Western blot检测BRL细胞中HSP70的表达。病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后,检测重组腺病毒纯度、颗粒滴度及感染性滴度。结果克隆质粒、穿梭质粒经PCR及酶切鉴定,均可见2 269 bp的目的基因条带,测序结果与GenBank登录的序列一致;XhoⅠ酶切结果显示,HSP70基因已正确克隆至腺病毒质粒中;重组腺病毒感染BRL细胞后,细胞中HSP70的表达量显著升高(P<0.01);重组腺病毒纯化后纯度为1.29,颗粒滴度为5.31×1012VP/ml,感染性滴度达1×1011pfu/ml。结论已成功构建Wistar大鼠HSP70基因重组腺病毒质粒,并制备出高滴度的重组腺病毒颗粒,为进一步研究HSP70的生物学活性及作用机制奠定了基础。     

hepaCAM基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

目的构建表达肝细胞黏附分子(Hepatocyte cell adhesion molecule,hepaCAM)基因的重组腺病毒质粒,并进行鉴定。方法以质粒pEGFP-N2-hepaCAM为模板,PCR扩增hepaCAM基因,克隆至腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将重组腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-hepaCAM经PmeⅠ线性化,转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM经PmeⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒AdI-hepaCAM,经大量扩增后,检测病毒滴度。RT-qPCR及Westernblot检测感染的BIU-87细胞内hepaCAM的表达。结果酶切鉴定证实重组腺病毒质粒pAdEasy-1-hepaCAM构建正确,重组腺病毒AdI-hepaCAM滴度可达1.6×1012pfu/ml,与空载体腺病毒组比较,经重组腺病毒感染的BIU-87细胞中hepaCAM mRNA及蛋白的表达均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带hepaCAM的重组腺病毒载体AdI-hepaCAM,为研究hepaCAM基因对膀胱癌细胞增殖的调控提供依据。     

重组腺病毒Ad-NLS-RARα的构建及其在K562细胞中的表达

目的构建含NLS-RARα基因的重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并检测其在K562细胞中的表达。方法以质粒pGBKT7-PML-RARα为模板,PCR扩增NLS-RARα基因,与穿梭质粒dTrace-TO4连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-TO4-NLS-RARα,经PmeⅠ酶切线性化后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒pAd-NLS-RARα,经PacⅠ酶切线性化后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-NLS-RARα,经4轮扩增后,测定重组腺病毒滴度,并进行PCR及测序鉴定;将重组腺病毒感染K562细胞,采用流式细胞术测定感染效率,RT-PCR法和Western blot法检测NLS-RARα在K562细胞中的转录及表达水平。结果重组腺病毒Ad-NLS-RARα经4轮扩增后,滴度可达6.9×108pfu/ml,PCR及测序鉴定证明构建正确,对K562细胞的感染效率可达70%左右;重组腺病毒Ad-NLS-RARα携带的NLS-RARα基因可在K562细胞中高效表达。结论已成功构建了重组腺病毒Ad-NLS-RARα,并在K562细胞中高效表达了NLS-RARα基因。     

重组腺病毒Ad-PML(NLS)-的构建及鉴定

目的构建携带PML(NLS-)基因的重组腺病毒,并观察其对白血病K562细胞增殖的影响。方法以质粒pCMV-HA-PML(NLS-)为模板,PCR扩增PML(NLS-)基因,与穿梭质粒pAdTrace-TO4连接,构建重组穿梭载体pAdTrace-TO4-PML(NLS-),经PmeⅠ酶切线性化后,转化入感受态BJ5183细菌,获得重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-),经PacⅠ酶切后,转染AD293细胞,获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-),经4轮扩增后,检测其滴度。采用RT-PCR法和Western blot法分别检测重组腺病毒中PML(NLS-)基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平;将重组腺病毒感染K562细胞,MTT法检测其对细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒pAd-PML(NLS-)经PCR和单酶切鉴定,证明构建正确;经4轮扩增,重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/ml;Ad-PML(NLS-)携带的PML(NLS-)能够在AD293细胞中稳定表达;与未感染组和空载病毒感染组相比,重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染的K562细胞的增殖活力明显增强(P<0.05)。结论成功构建了重组腺病毒Ad-PML(NLS-),其可促进K562细胞的增殖,表明PML(NLS-)可能具有促癌基因的作用。     

c-ski基因重组腺病毒质粒的构建及其对肿瘤相关成纤维细胞增殖的影响

目的构建携带c-ski基因的重组腺病毒质粒,并检测其对肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)增殖活力的影响。方法以pcDNA3-c-ski质粒为模板,PCR扩增c-ski基因,与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,构建重组穿梭质粒pAdTrack-c-ski,经PmeⅠ线性化后,转化感受态大肠埃希菌BJ5183,获得重组腺病毒质粒,经PacⅠ线性化后,转染HEK-293细胞,获得重组腺病毒,经扩增及纯化后测定病毒滴度。将纯化的重组腺病毒感染乳腺癌CAFs,采用Western blot法检测感染细胞中c-Ski蛋白的表达水平;MTT法和细胞计数法检测重组腺病毒对CAFs细胞增殖活力的影响。结果重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切鉴定证明构建正确;转染HEK-293细胞48 h后可见大量绿色荧光蛋白的表达,纯化的重组腺病毒的滴度为3.11×1010IFU/ml;感染重组腺病毒的乳腺癌CAFs中c-Ski蛋白的表达水平明显高于空病毒组和空白对照组(P<0.001),且增殖活力明显高于空白对照组(P<0.05)。结论成功构建了表达c-ski基因的重组腺病毒质粒,其可明显促进CAFs的增殖,为进一步研究c-Ski对CAFs增殖分化等生物学功能的影响及作用机制提供了实验依据。     

人GINS2基因重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的利用AdEasy系统构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,并进行鉴定。方法以pcDNA3.1-GINS2质粒为模板,PCR扩增GINS2基因,克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2,经双酶切及测序鉴定正确的阳性质粒与骨架质粒pAdEasy-1同时转化感受态大肠杆菌BJ5183,经同源重组获得重组腺病毒质粒pAdE-GINS2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-GINS2,大量扩增后,测定病毒滴度,进行PCR鉴定。Western blot法检测重组腺病毒感染的人HL60细胞中GINS2蛋白的表达,MTT法检测重组腺病毒感染对HL60细胞增殖的影响。结果重组腺病毒穿梭质粒pAdT-GINS2经双酶切及测序证明构建正确;经酶切鉴定证明重组腺病毒质粒pAdE-GINS2构建正确;经PCR鉴定证明重组腺病毒Ad-GINS2包装成功,经3轮扩增后病毒滴度可达1.35×1012IU/ml;与空载体感染及未感染的HL60细胞相比,重组腺病毒感染的HL60细胞内GINS2蛋白的表达及细胞增殖水平均明显升高(P<0.05)。结论已成功构建携带人GINS2基因的重组腺病毒表达质粒,感染人HL60细胞后可促进其增殖,为进一步研究该基因在急性髓细胞白血病发生发展中的作用奠定了基础。     

PLCε基因shRNA重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标签的表达PLCε基因shRNA的重组腺病毒质粒Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究膀胱癌的基因治疗奠定基础。方法将干扰质粒pGenesil-PLCε及阴性对照质粒pGenesil-NP的表达启动子U6及shRNA序列克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的穿梭质粒pAdTrack,经酶切及测序鉴定正确后,将重组穿梭质粒经PmeI线性化,转化感受态AdEasier。重组pAdEasy-U6-PLCε质粒经PacI线性化后,转染HEK-293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-PLCε,经大量扩增后测定病毒滴度,RT-PCR及Western blot检测T24细胞内PLCε的表达情况。结果酶切及测序鉴定证实pAdTrack-U6-PLCε及重组pAdEasy-U6-PLCε质粒构建正确,并成功转染至HEK-293细胞,重组腺病毒Ad-U6-PLCε滴度达1.5×1012,经重组腺病毒感染的T24细胞内PLCεmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。结论已成功构建针对PLCε基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-PLCε,为应用基因沉默技术研究PLCε对膀胱癌发生发展的作用奠定了基础。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。