一株柯萨奇病毒B2分离株的VP1基因序列特征分析

目的分析一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)B2分离株(CVB2)全VP1基因序列特征。方法用RD细胞对10份HFMD疑似患儿的粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1基因,并测序,采用NCBI BLAST、Mega 6.1和Geneious等软件进行序列分析,并构建系统进化树。结果从10份HFMD疑似患儿粪便中分离到一株CVB2,命名为509/YN/CHN/2010,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVB2一致,均为846 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~95.3%和97.9%~98.9%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.1%~87.8%和97.9%~98.6%。在进化树上与其他中国分离株分属不同的两个分支,而与M10MG17亲缘关系较近。结论 509/YN/CHN/2010分离株为肠道病毒CVB2,为两个中国分支中的一支。     

柯萨奇B组1型病毒株MSH-KM9-09的分离鉴定及其VP1基因序列特征分析

目的对2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B组1型病毒(Coxsackievirus B1,CVB1)分离株MSH-KM9-09进行鉴定,并分析其VP1基因的序列特征。方法采用RD细胞和Hep-2细胞对22份疑似无菌性脑膜炎患者脑脊液标本进行病毒分离,采用微量中和试验,经WHO肠道病毒组合血清及单价血清对分离株进行鉴定,RT-PCR法扩增病毒全长VP1基因,进行序列测定,并采用Mega 4.1等软件进行分析。结果所分离的毒株经微量中和试验定型为CVB1亚型,编号为MSH-KM9-09。经RT-PCR扩增获得834 bp的VP1基因,与国内CVB1分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在86.1%和97.8%以上,与国外CVB1分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80.2%～83.2%和94.3%～96.0%;在系统进化树上,MSH-KM9-09株与国内分离株属于同一个分支,而国外分离株分属其他两个不同的分支。结论 MSH-KM9-09分离株为肠道病毒CVB1。     

一株柯萨奇病毒A9分离株的VP1基因遗传特征分析

目的分析引起病毒性脑炎(viral encephalitis,VE)的一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)A9分离株(CVA9)的VP1基因遗传特征。方法采用KMB17细胞对VE患儿粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1全基因,并测序,采用Mega 6.1和Geneious 5.6.5等软件分析其序列,并构建系统进化树。结果从5份VE患儿粪便中分离到一株人CVA9,命名为A108/YN/CHN/2009,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVA9一致,均为906 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.4%~98.2%和96.4%~99.3%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~96.0%和92.7%~99.0%。在进化树上与其他中国分离株属同一分支中不同两个亚分支,与JB141230009亲缘关系较近。结论 A108/YN/CHN/2009分离株为肠道病毒CVA9血清型,与其他中国分离株同属一个基因簇。     

柯萨奇病毒B组5型的研究进展

柯萨奇病毒B组5型(Coxsakievirus B5,CV-B5)引起的轻症包括上呼吸道感染、腹泻及手足口病(hand-footmouth disease,HFMD),也可引起病毒性脑炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、弛缓性麻痹、扩张性心肌炎等多种重症疾病,其中无菌性脑膜炎及病毒性脑炎呈全球范围分布,发病年龄主要集中于18岁以下的青少年人群,多发于夏秋季节。另外,CV-B5感染也是导致胰岛素依赖型(Ⅰ型)糖尿病的主要诱发因素之一,还可引起短暂性失语症和小儿急性横贯型脊髓炎等罕见临床症状。本文就CV-B5的病原学、流行病学、实验室诊断及动物模型等方面的研究进展作一综述。     

2019年云南省昆明市柯萨奇病毒A组16型毒株的分离鉴定及其VP1基因遗传特征分析

目的 对2019年云南省手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）患者粪便中分离获得的柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）毒株的全VP1基因遗传特征进行分析。方法 使用人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞分离病毒,设计针对CVA16全VP1基因序列引物,采用RT-PCR扩增目的基因片段并测序;利用MEGA 7.0和Geneious 9.0.2等软件对全VP1序列进行分析。结果 共分离获得26株CVA16毒株,其中有8株KMB-17分离株和18株Vero分离株。随机选取20株CVA16分离株进行分析,发现3株B1a和17株B1b基因亚型;其中17株CVA16 B1b分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.8%～100%和98.3%～100%,与国内其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性为91.1%～99.2%和97.3%～99.0%;3株B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为98.0%～98.1%和99.3%,与国内其他B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为88.7%～98.7%和98.3%～99.7%;17株B...     

柯萨奇B4病毒jlu06株基因序列及遗传进化分析

目的对柯萨奇B4病毒(CVB4)jlu06株进行基因序列及遗传进化分析,并探讨其与致病相关的分子基础。方法Trizol法提取病毒RNA,RT-PCR扩增目的基因片段,测定基因组全序列,并进行序列同源性及遗传进化分析。结果CVB4 jlu06株基因组全长7 395个核苷酸,编码2 183个氨基酸,与其他CVB4株的同源性较高,且发生了10个氨基酸的变异,与HumanCB4和POLG_CXB4亲缘关系较近,与CXB2亲缘关系较远;CVB4 jlu06株与具有潜在致糖尿病性病毒株,在非结构蛋白3A区4个位点有共同的氨基酸,与非致病毒株不同。结论CVB4 jlu06株具有典型的CVB4基因组特征,在非结构蛋白3A区发生的核苷酸和氨基酸变异可能与其致病性相关。     

柯萨奇病毒A组16型疫苗候选株减毒特性的分析

目的对柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)减毒活疫苗候选株进行初步分析,为CA16减毒活疫苗的研制奠定基础。方法将两株CA16疫苗候选株(KM168和KM154)进行低温连续传代减毒,对不同代次病毒进行减毒特性的分析。将候选株病毒收获液免疫ICR乳鼠(颅内注射)及ICR成鼠(腹腔注射),分别评价减毒疫苗候选株的毒力、免疫原性以及乳鼠作为减毒活疫苗残余毒力评价动物模型的可行性;对病毒进行VP1片段的测序,分析遗传稳定性。结果两个候选株经低温连续传代后,均具有稳定的生长特性及良好的免疫原性,感染性滴度均保持在约7.0 Lg CCID50/ml,免疫小鼠后抗体阳转率达100%,最高GMT约1∶30。乳鼠及成鼠感染病毒后,在大部分组织中能检测到CA16病毒;KM154株在第12代后未对乳鼠产生临床致病性及致死率,病理检测结果主要表现为少量炎性细胞集结,无明显组织损伤,随着传代增加,组织损伤明显减少。两个候选株经低温连续传代后,能保证VP1片段的遗传稳定性。结论低温连续传代可使CA16的毒力明显降低,有望筛选出减毒活疫苗的候选株;1~2日龄ICR乳鼠可以作为CA16减毒活疫苗的候选株毒力评价的动物模型。     

柯萨奇病毒A组16型免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析

目的对柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus groups A type 16,CoxA16)4个毒株进行免疫原性及毒株间交叉保护能力的比较分析。方法提取CoxA16 G20、KM/M08、MY08和KM208病毒RNA,PCR扩增VP1基因,并进行测序;利用MEGA4.0软件中Bootstrap Test of phylogeny→Neighbor-joining方法对13株CoxA16基于VP1基因全序列构建CoxA16种系进化树并进行基因分型,使用DNAMAN软件对4个毒株VP1核苷酸序列的同源性及其蛋白质氨基酸序列差异位点进行分析。分别用纯化灭活后的4株CoxA16免疫BALB/c小鼠,于初次免疫和二次免疫后的第14、28天采血,分离血清,Western blot法检测G20毒株免疫的小鼠血清中抗体的的特异性;微量中和试验法检测血清中和抗体效价并进行交叉中和试验。结果 G20、MY08和KM208毒株属于B2b基因型,而KM/M08毒株属于B2a基因型;4个毒株间VP1基因核苷酸序列的同源性为91.8%～99.0%;MY08与其他3个毒株相比,在VP1的第102位(N→D)、241位(E→K)和248位(T→A)上存在3个差异氨基酸位点。G20毒株的抗血清可特异识别CoxA16的VP1和VP2蛋白,具有良好的免疫原性;各实验组二次免疫后第28天中和抗体效价均高于其他检测时期,其中MY08组中和抗体效价明显低于其他3组,差异有统计学意义(P﹤0.01);G20、KM/M08、和KM208毒株间的交叉保护能力优于MY08毒株对G20、KM/M08和KM208毒株的交叉保护能力,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论 4株CoxA16灭活后均能诱导机体产生相应的中和抗体和交叉保护能力,其中G20、KM/M08和KM208毒株在灭活后,显示了更好的免疫原性和毒株间交叉保护能力。     

33株柯萨奇病毒A组16型分离株的全基因序列分析

目的对2008～2010年北京和青岛地区流行的33株柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CA16)分离株的全基因序列进行分析。方法收集2008～2010年北京和青岛地区CA16感染患者咽拭子标本,采用Vero细胞对病毒进行分离,并经噬斑纯化。提取病毒RNA,采用RT-PCR法分段扩增CA16全长基因,经序列测定和拼接后,利用DNAStar和MEGA5.10软件分析全基因序列。结果经病毒分离和噬斑纯化,共获得33株CA16分离株;33个分离株之间的核苷酸序列同源性大于90.9%,与CA16国际标准株G10各区段的核苷酸序列同源性为72.7%～89.0%,氨基酸序列同源性为79.3%～100.0%;与近年中国分离的CA16 SZ/HK08-7株同源性较高,全基因组同源性大于91.5%,各区段核苷酸序列同源性均大于83.7%;在基于VP1序列的种系进化树中,BJWG16、BJWG17、BJWG20等23个分离株属于C1亚型,其余10个分离株属于C3亚型。结论 2008～2010年北京和青岛地区流行的33株CA16分离株均为C基因型。本研究对我国CA16分子流行病学、毒力位点的研究以及疫苗株的选择具有重要意义。     

云南省1株柯萨奇病毒A组8型分离株全基因组分析

目的 分析柯萨奇病毒A组8型（Coxsackievirus A8,CVA8）云南分离株A8-1/YN/CHN/2019全基因组序列及其遗传特性,以期了解CVA8的流行和变异情况。方法 设计针对CVA8的引物,提取病毒RNA,RT-PCR扩增VP1序列并测序,BioEdit 7.2.3拼接得到全基因组,使用MEGA 7.0软件进行系统进化分析,应用Simplot 3.5.1及RDP4软件进行重组分析。结果 A8-1/YN/CHN/2019株长7 396 nt,编码2 188个氨基酸。其VP1与CVA8原型株AF081299/Donovan/USA/1998核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为81.04%和95.24%;A8-1/YN/CHN/2019株属于基因型E,其他中国分离株位于D和E型。重组分析发现A8-1/YN/CHN/2019株在非结构编码区的P2和P3段上发生重组。结论 A8-1/YN/CHN/2019株为E基因型,并在P2、P3段的非结构区发生了重组事件。     

埃可病毒9型分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征

目的分析2010年昆明市引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原埃可病毒9型(Echovirus 9,E9)分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征。方法分别采用RD细胞和Hep-2细胞对3份HFMD患儿粪便标本进行病毒分离,应用RT-PCR法分2段扩增病毒VP1基因,并进行序列测定。应用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行比对;Omiga软件对所测定的节段序列的核苷酸及推导的氨基酸序列进行编辑、比对和拼接;应用Mega 5.05软件进行序列分析,并与15个E9参考株的VP1基因序列进行比较,构建基因系统进化树。结果从3份HFMD患儿粪便标本中分离到1株E9,命名为MSH-KM812,其VP1区的核苷酸长度为888 bp。MSH-KM812株与其他15个E9参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.6%～98.0%和87.5%～99.3%,与中国分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.7%～98.0%和97.0%～99.3%,其中与中国江苏分离株M10MF37 China2010核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为98.0%和99.3%,而与德国分离株Hill的核苷酸和氨基酸序列同源性最低,分别为78.6%和87.5%。基因进化树分析显示,MSH-KM812分离株与中国江苏分离株M10MF37 China 2010和中国山东分离株05189-SD-CHN-2005-E9属于同一个进化分枝。结论 MSH-KM812分离株为E9,与中国其他分离株同属一个进化分枝。     

肠道病毒71型甘肃分离株VP1基因特征分析

目的分析肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)甘肃分离株VP1基因的特征。方法应用RT-PCR法扩增4株EV71甘肃分离株(46F、47F、51F和55F)的VP1基因,克隆入pTA2载体,进行核苷酸序列测定,并进行序列的同源性比较及进化树分析。结果 4株病毒VP1核苷酸序列长度均为891bp,推导的氨基酸序列含297个氨基酸。51F与55F毒株核苷酸和氨基酸同源性均为100%,46F与47F的同源性分别为99.6%和99.0%,4株病毒与EV71的C4亚型毒株核苷酸同源性在96%以上,氨基酸同源性在99%以上。同源性和进化树分析显示,4株分离株分属2个群,其中51F和55F毒株同属一个群,其与昆明分离株kunming41-08亲缘关系最为相近;46F和47F同属一个群,其与内蒙分离株0723F/NM/CHN/07关系最为相近。结论 4株EV71甘肃分离株属于C4亚型,为中国EV71的基因分型、分子流行病学研究提供了参考。     

安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒的N基因序列分析

目的对安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的N基因进行序列分析,并比较其与代表性RABV街毒株及疫苗株之间的差异。方法采集安徽省淮北地区狗肉市场的犬脑组织121份,伤人犬脑组织10份,采用直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测RABV抗原,并通过颅内接种昆明乳鼠进一步鉴定毒株;RT-PCR扩增分离病毒的N基因,与pMD18-T载体连接测序后,与代表性RABV街毒株及疫苗株的N基因序列进行比对,并进行遗传学分析。结果在送检的131份犬脑组织样品中检出RABV阳性19株,其中伤人犬脑组织阳性率为90%,狗肉市场犬脑组织阳性率为8.26%。19株RABV N基因核苷酸序列同源性为97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性为98.7%～100%;与代表性人用和兽用RABV疫苗株相比,N基因核苷酸序列同源性为85.4%～89.9%,推导的氨基酸序列同源性为94.9%～99.1%,核苷酸序列的变异主要为同义突变。分离的19株RABV在系统进化树上高度聚集,与以往国内分离的代表性街毒株系统进化关系较近,在同一个分支(HN10除外)与我国疫苗株CTN-181株亲缘关系最近,处于同一个亚群。结论从安徽省伤人犬和狗肉市场的犬脑组织中成功分离并鉴定了19株RABV,这些病毒株均属于基因I型RABV,且具有地域性特征。本研究对特定区域RABV的流行及监测具有一定的意义。     

吉林省首次分离的2B基因型风疹病毒株的基因特征分析

目的分析吉林省首次分离的2B基因型风疹病毒株的基因特征。方法采集病例咽拭子标本,提取核酸,通过Real-time PCR进行风疹初筛,阳性标本接种于淋巴信号激活因子转染的非洲绿猴肾细胞(Vero cell transfected to express the human singaling lymphacyte actiration molecule,Vero/SLAM),进行病毒分离,采用RT-PCR法扩增病毒分离物的E1基因目的片段,并对扩增产物进行序列测定及分析。结果 4份咽拭子标本经Real-time PCR鉴定均为阳性,病毒分离获得2株风疹病毒株,序列测定分析结果均为2B基因型,氨基酸和核苷酸序列同源性均为100%。与全国近年流行的2B基因型比较,处于一个相对独立的分支。结论吉林省自2008年开展风疹病毒病原学监测以来,首次监测到2B基因型风疹野病毒,丰富了吉林省风疹病毒基因库。     

肠道病毒71型吉林分离株的全基因组序列分析

目的对2011年吉林省肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)分离株全基因组进行序列分析。方法将手足口病伴发重症脑炎患者的粪便样品接种至Vero细胞,分离EV71;采用RT-PCR法分8段扩增全基因组序列,进行双酶切及序列测定;应用Mega5软件构建EV71系统进化树;通过DNAMAN7和DNASTAR7软件进行EV71分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性比较;经RDP4软件对EV71分离株进行同源重组分析。结果粪便样品接种至Vero细胞2 d后,细胞出现圆缩、透亮、聚堆的病变现象;各PCR扩增产物经双酶切鉴定,均可见与预期大小一致的目的条带;经种系进化树分析显示,EV71分离株属C4a亚型,命名为EV71-JiLin-11-China;其与A、B和C亚型间核苷酸序列的平均同源性分别为22.44%、17.72%和11.96%,与A、B和C亚型间氨基酸序列的平均同源性分别为96.0%、97.2%和97.3%;全基因同源重组分析显示,EV71分离株的165～1 946和7 289～7 366核苷酸区有重组现象,分别源于分离自湖北的C4a-EV71-Hubei-09-China及马来西亚的B4-SB2864-SAR-00和C1-S18062-SAR-98。结论 2011年吉林地区流行的EV71为C4a基因型,为EV71基因特征及流行病学的研究提供了实验依据。     

5-O-叔丁基二甲基硅基阿维菌素的合成

以阿维菌素和叔丁基二甲基硅基氯为原料合成 5 O 叔丁基二甲基硅基阿维菌素。其优惠工艺条件为 :反应温度 2 0℃ ,反应时间 2h,阿维菌素∶叔丁基二甲基硅基氯 =1∶3(mol/mol) ,产品收率≥ 90 % ,含量≥ 82 %。     

重庆地区5岁以内儿童腹泻病毒病原及流行病学特点

目的了解重庆地区5岁以内儿童腹泻病毒病原及流行病学特点。方法收集重庆医科大学附属儿童医院2010年8～11月就诊的5岁以内腹泻患儿的粪便标本共500份,采用胶体金法检测A组轮状病毒(Rotavirus,RV),RT-PCR法检测B、C组RV、诺如病毒(Norovirus,NV)GⅠ和GⅡ、肠道腺病毒(Adenovirus,ADV)、札如病毒(Sapovirus,SLV)和星状病毒(Astrovirus,ASV),取NV和SLV阳性PCR产物测序,并对病毒基因进行分型。采用MEGA 5.05软件构建进化树,Kimura’s two-parameter法计算遗传距离,邻接法(Neighbor-joining)boot-strap重复检验1 000次。结果 500份标本中,检测到A组RV阳性标本134份,阳性率为26.8%;NV GⅡ型阳性标本132份,阳性率为26.4%;ADV阳性标本31份,阳性率为6.2%;SLV阳性标本9份,阳性率为1.8%;ASV阳性标本1份,阳性率为0.2%;未检测到B、C组RV和NV GⅠ型。随机选择22份NV阳性标本进行测序及基因分型,其中GⅡ/4占绝对优势,其次为GⅡ/6、GⅡ/2、GⅡ/3和GⅡ/7。SLV可分为4个基因亚型,其中GⅠ/1为优势株,其次为GⅠ/2、GⅡ/1和GⅠV 1。结论重庆地区5岁以下儿童腹泻以病毒感染为主,RV是主要的病原体,其次为NV、ADV、SLV和ASV。     

Bioinformatics and Screening of a Circular RNA-microRNA-mRNA Regulatory Network Induced by Coxsackievirus Group B5 in Human Rhabdomyosarcoma Cells

Hand, foot and mouth disease (HFMD) caused by Coxsackievirus Group B5 (CVB5) is one of the most common herpetic diseases in human infants and children. The pathogenesis of CVB5 remains unknown. Circular RNAs (CircRNAs), as novel noncoding RNAs, have been shown to play a key role in many pathogenic processes in different species; however, their functions during the process of CVB5 infection remain unclear. In the present study, we investigated the expression profiles of circRNAs using RNA sequencing technology in CVB5-infected and mock-infected human rhabdomyosarcoma cells (CVB5 virus that had been isolated from clinical specimens). In addition, several differentially expressed circRNAs were validated by RT-qPCR. Moreover, the innate immune responses related to circRNA-miRNA-mRNA interaction networks were constructed and verified. A total of 5461 circRNAs were identified at different genomic locations in CVB5 infections and controls, of which 235 were differentially expressed. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis demonstrated that the differentially expressed circRNAs were principally involved in specific signaling pathways related to ErbB, TNF, and innate immunity. We further predicted that novel_circ_0002006 might act as a molecular sponge for miR-152-3p through the IFN-I pathway to inhibit CVB5 replication, and that novel_circ_0001066 might act as a molecular sponge for miR-29b-3p via the NF-κB pathway and for the inhibition of CVB5 replication. These findings will help to elucidate the biological functions of circRNAs in the progression of CVB5-related HFMD and identify prospective biomarkers and therapeutic targets for this disease.     

Genome-Wide Identification of TaSAUR Gene Family Members in Hexaploid Wheat and Functional Characterization of TaSAUR66-5B in Improving Nitrogen Use Efficiency

Excessive input of nitrogen fertilizer not only causes a great waste of resources but brings about a series of ecological and environmental problems. Although Small Auxin Up-regulated RNAs (SAURs) participate in diverse biological processes, the function of SAURs in the nitrogen starvation response has not been well-studied. Here, we identified 308 TaSAURs in wheat and divided them into 10 subfamilies. The promoter regions of most TaSAURs contain hormone responsive elements, and their expression levels change under the treatment of different hormones, such as IAA, MeJA, and ABA. Interestingly, overexpression of one of the TaSAUR family members, a nitrogen starvation responsive gene, TaSAUR66-5B, can promote the growth of Arabidopsis and wheat roots. In addition, overexpression of TaSAUR66-5B in Arabidopsis up-regulates the expression levels of auxin biosynthesis related genes, suggesting that overexpression TaSAUR66-5B may promote root growth by increasing the biosynthesis of auxin. Furthermore, overexpression of TaSAUR66-5B in wheat can increase the biomass and grain yields of transgenic plants, as well as the nitrogen concentration and accumulation of both shoots and grains, especially under low nitrogen conditions. This study provides important genomic information of the TaSAUR gene family and lays a foundation for elucidating the functions of TaSAURs in improving nitrogen utilization efficiency in wheat.