人干扰素λ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建及其转录活性分析

目的构建人干扰素λ1(interferonλ1,IFNλ1)基因启动子荧光素酶报告基因载体,并探讨仙台病毒及质粒IRF3-5D和HA-IRF7对其转录活性的影响。方法提取BEAS-2B细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增IFNλ1基因启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-enhancer,构建IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc,将其转染293T细胞,同时用质粒IFNβ-luc和pGL3-enhancer转染作为对照。转染24 h后感染仙台病毒,于感染前和感染后4、12、18和24 h收集细胞,进行双荧光素酶活性检测;用质粒IRF3-5D或HA-IRF7与质粒IFNL1-luc共转染,36 h后收集细胞,进行双荧光素酶活性检测。结果 IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;分别转染质粒IFNL1-luc和IFNβ-luc的细胞感染仙台病毒后,荧光素酶活性倍数均随时间延长呈明显上升趋势,至18 h达到峰值(分别为1 000倍和2 300倍),转染质粒pGL3-enhancer的细胞感染仙台病毒后,不同时间点收集的细胞,荧光素酶活性倍数一直处于较低水平;质粒HA-IRF7或IRF3-5D对IFNL1-luc的活化倍数明显高于pGL3-enhancer(P0.05)。结论成功构建了IFNλ1基因启动子荧光素酶报告基因质粒IFNL1-luc,仙台病毒及质粒IRF3-5D和HA-IRF7均能激活IFNL1-luc的转录,为进一步研究调控IFNλ1表达的信号转导通路奠定了基础。     

小鼠Fancd2os基因真核表达质粒的构建及其对人胚肾上皮细胞增殖和凋亡的影响

目的构建小鼠Fancd2os基因的真核表达质粒,并分析Fancd2os基因对人胚肾上皮细胞(HEK293T)增殖和凋亡的影响。方法以小鼠睾丸组织DNA为模板扩增Fancd2os基因c DNA全长片段,并克隆至真核表达载体p3×FLAG-CMV-14,构建重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os。经Lipofectamine TM 2000将重组真核表达质粒瞬时转染HEK293T细胞,分别采用RT-PCR及Western blot法检测转染细胞中Fancd2os基因m RNA转录及蛋白表达情况;经CCK8法和流式细胞术分别检测过表达Fancd2os对HEK293T细胞增殖能力及紫外线诱导HEK293T细胞凋亡的影响。结果经双酶切及测序鉴定,重组真核表达质粒p3×FLAG-CMV-14-Fancd2os构建正确;转染p3×Flag-CMV-14-Fancd2os的HEK293T细胞可见Fancd2os基因m RNA转录及其蛋白表达;过表达Fancd2os的HEK293T细胞的增殖活性显著下降(P0.05);过表达Fancd2os可显著促进紫外线诱导的HEK293T细胞凋亡(P0.01)。结论成功构建了重组真核表达质粒p3×Flag-CMV-14-Fancd2os,过表达Fancd2os可抑制HEK293T细胞的增殖,促进其凋亡。     

双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为筛选携带报告基因的肿瘤细胞系提供分子工具。方法以质粒pcDNA3. 1、pcDNA6-GFP、pSVA-Luc为模板,分别扩增CMV、GFP和Luc基因序列,通过In-fusion法将3个基因片段与经HindⅢ、XhoⅠ双酶切的pcDNA3. 1载体连接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP,转染293T细胞,荧光显微镜直接观察GFP的表达,化学发光仪检测Luc的表达。提取293T细胞总RNA,RT-PCR法扩增p53基因,通过In-fusion法将p53基因连接于质粒pC-T2A-Luc-GFP上,构建质粒pC-p53-T2A-Luc-GFP,转染293T细胞,Western blot法检测p53的表达,化学发光仪检测Luc的表达。结果重组真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP经酶切及测序鉴定构建正确,GFP和Luc双报告基因均可在293T细胞中正确表达,且可用于后续的动物模型建立。pC-p53-T2A-Luc-GFP质粒中p53的插入降低了Luc的表达,但其表达仍为阳性,不影响Luc的正常检测。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP,并可在293T细胞中表达,为建立携带报告基因的肿瘤细胞系及肿瘤模型奠定了分子基础。     

双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞内进行表达。方法分别以pEGFP-N1和pDsRed-N1为模板,PCR扩增EGFP和DsRed基因,插入表达载体pCI中,分别构建重组表达质粒pCI-EGFP和pCI-DsRed,利用载体上BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特点,将两个表达质粒酶切后拼接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP,转染293T细胞,荧光显微镜观察EGFP和DsRed的表达,Western blot和流式细胞术检测EGFP和DsRed蛋白的表达。结果重组真核表达质粒pCI-cmvDsRed-cmvEGFP经酶切鉴定和测序证实构建正确,两启动子为顺向相连;EGFP和DsRed蛋白在293T细胞中可同时正确表达。结论成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为实现两种外源基因在真核细胞内的同步表达及示踪提供了有效的分子工具。     

小鼠丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2基因真核重组表达质粒的构建及其对微管蛋白聚合的影响

目的构建小鼠丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2,SRPK2)基因(srpk2)的真核重组表达质粒,并分析其对微管蛋白α-Tubulin聚合的影响。方法利用RT-PCR法扩增srpk2的全长cDNA序列,通过分子克隆技术构建真核重组表达质粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2;在脂质体Lipofectamine 2000的介导下,将真核重组表达质粒及空载体pLV-EGFP2(A)Puro分别转染人胚肾HEK293T细胞,同时设空白对照组(未转染)。采用RT-PCR及Western blot法分别检测HEK293T细胞中srpk2基因mRNA转录及SRPK2蛋白的表达情况;Western blot法分析HEK293T细胞中聚合态和游离态α-Tubulin的含量。结果双酶切及DNA序列鉴定证明真核重组表达质粒pLV-EGFP2(A)Puro-srpk2构建正确,且在HEK293T细胞中实现了srpk2基因过表达。真核重组表达质粒转染组HEK293T细胞中游离态α-Tubulin含量显著低于空载体转染组及空白对照组(P0.05),而聚合态α-Tubulin水平明显高于空载体转染组及空白对照组(P0.05)。结论成功构建了srpk2基因的真核重组表达质粒,SRPK2可促进α-Tubulin微管蛋白聚合。     

RECK基因3′UTR荧光素酶报告基因载体的构建

目的构建RECK(reversion-inducing cysteine-rich protein with kazal motifs)基因mRNA 3′非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)全长及两个截短片段的荧光素酶报告基因载体,以进一步研究microRNA对RECK基因的调控。方法以人乳腺癌细胞系MCF-7基因组DNA为模板,PCR扩增RECK基因mRNA的3′UTR全长及两个截短片段,利用双酶切将目的片段定向插入报告基因载体pGL3-Control中,将克隆载体转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行扩增,采用菌落PCR、双酶切、测序鉴定重组子,双荧光报告基因检测其表达活性。结果重组载体中RECK3′UTR序列与GenBank序列比对一致且插入方向正确;3个重组载体分别命名为pGL3-RECK 3′UTR-1、pGL3-RECK3′UTR-2和pGL3-RECK 3′UTR-3,转染细胞后可表达荧光素酶基因。结论成功构建了RECK基因3′UTR全长及两个截短片段的荧光素酶报告基因载体,为进一步研究microRNA对靶基因RECK的调控奠定了基础。     

锌指蛋白转录抑制因子145′非翻译区内部核糖体进入位点的活性

目的检测锌指蛋白转录抑制因子14(positive regulatory domain zinc finger protein 14,PRDM14)5′非翻译区(5′untranslated region,5′UTR)内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)的活性。方法 PCR扩增PRDM14 5′UTR各截短序列的基因及全长基因,分别插入至双荧光素酶和红绿荧光报告基因中,构建重组质粒p RLPRDM14 S1-FL、p RL-PRDM14 S2-FL、p RL-PRDM14 S3-FL及p G-PRDM 14-R。将各重组质粒分别转染HEK293细胞,检测PRDM14 5′UTR IRES元件的活性、内部剪切位点和自身启动子的活性及影响IRES活性的序列。将重组质粒p RL-FL/5′UTR分别转染HCT-8/WT、Hep-2、Bel7402/WT和NIH3T3细胞,检测各细胞中PRDM14 5′UTR IRES元件的活性。结果 PRDM14 5′UTR具有内部核糖体进入位点元件活性;不具有内部剪切位点和自身启动子活性;PRDM14 5′UTR的活性激活中心位于25~60 nt,活性抑制中心位于60~95 nt;除NIH3T3细胞外,其他细胞均具有IRES活性。结论 PRDM14 5′UTR具有典型的IRES活性,为今后深入研究PRDM14表达的调控机制奠定了基础。     

高表达转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒的构建及鉴定

目的构建转录因子ZNF191基因的慢病毒颗粒,为进一步研究ZNF191的生物学功能及其在肿瘤基因治疗方面的应用奠定基础。方法从HEK293细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增ZNF191基因,亚克隆至pLVX-AcGFP-N1质粒中,经酶切及DNA测序鉴定正确后,将含有ZNF191基因的重组质粒pLVX-ZNF191结合辅助质粒转染HEK293T细胞,包装重组慢病毒,Western blot检测感染的293T细胞内ZNF191蛋白的表达。结果酶切及测序鉴定pLVX-ZNF191质粒构建正确,Western blot检测重组慢病毒能显著提高293T细胞的ZNF191蛋白表达水平。结论已成功构建了ZNF191基因重组慢病毒表达载体pLVX-ZNF191,为进一步研究ZNF191的生物学功能及肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶基因的克隆表达及活性鉴定

目的克隆表达小鼠截短型可溶性腺苷酸环化酶(mtsAC)基因,并检测其活性,为后续研究提供技术平台。方法Trizol法提取小鼠睾丸组织总RNA,RT-PCR法扩增mtsAC基因,经测序正确后,克隆至真核表达载体pcDNA4-V5,转染HEK293T细胞,Western blot及免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达,并检测HEK293T细胞中cAMP的水平。结果所构建的重组表达质粒pcDNA4-V5-mtsAC经酶切和测序证明构建正确,插入的mtsAC基因长度为1549bp;表达的重组mtsAC蛋白相对分子质量为48000,在胞浆及胞核中呈均一性表达;转染质粒pcDNA4-V5-mtsAC的HEK293T细胞中cAMP的水平较未转染的HEK293T细胞升高约17倍,并可被NaHCO3和CaCl2激活。结论已成功克隆了mtsAC基因,并在HEK293T细胞中表达了具有活性的重组mtsAC蛋白,建立了可用于mtsAC特性研究及男性不育药物筛选的技术平台。     

抗菌肽PR-39重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

目的构建抗菌肽PR-39(Proline-arginine rich 39-amino acid peptide,PR-39)重组腺病毒表达质粒。方法从含抗菌肽PR-39核心编码区的质粒中扩增PR-39基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrace-TO4中,构建重组穿梭质粒,经PmeⅠ酶切线性化后,转化感受态AdEasier细胞,构建重组腺病毒质粒,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度检测。将重组腺病毒感染鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2,通过荧光显微镜观察红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)的表达,RT-PCR法检测PR-39基因的转录水平。结果重组腺病毒穿梭质粒pAd-Trace-TO4-PR-39经KpnⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组腺病毒质粒pAdPR-39经PacⅠ酶切鉴定,证明目的基因已整合到腺病毒基因组中;第4代重组腺病毒AdPR-39的病毒滴度为1010IU/ml;感染重组腺病毒AdPR-39的C3H10T1/2细胞可表达RFP;PR-39基因在C3H10T1/2细胞内成功转录。结论已成功构建携带RFP的PR-39重组腺病毒表达质粒,在鼠胚胎间充质干细胞C3H10T1/2中可高效表达。     

Lipocalin-2基因表达产物对人胚肾细胞增殖的影响

目的构建Lipocalin-2(Lcn-2)基因真核表达质粒PL-2,并检测其及前期原核表达的重组Lcn-2蛋白对人胚肾细胞HEK293增殖的影响。方法利用RT-PCR从鼠巨噬细胞RAW264.7中扩增Lcn-2基因,克隆入真核表达质粒pEGFP-C1中,构建重组质粒PL-2。转染HEK293细胞,通过荧光观察和RT-PCR鉴定Lcn-2基因的表达。将重组质粒PL-2和前期原核表达的重组Lcn-2蛋白作用于HEK293细胞,通过MTT法检测细胞增殖情况,Westernblot法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。结果重组真核表达质粒PL-2经酶切和测序鉴定,证明构建正确。经荧光观察和RT-PCR鉴定,转染重组质粒PL-2的HEK293细胞中有Lcn-2基因的表达。加入重组Lcn-2蛋白后,HEK293细胞较对照组明显增殖,细胞中PCNA的表达也较对照组明显升高,而重组质粒PL-2对HEK293细胞增殖以及细胞中PCNA的表达均无影响。结论已成功构建了Lcn-2基因真核表达质粒,其对HEK293细胞的增殖无影响,而原核表达的重组Lcn-2蛋白对HEK293细胞的增殖有一定的促进作用,推测Lcn-2基因的表达产物可能通过与细胞膜受体结合促进HEK293细胞的增殖。     

重组丙型肝炎病毒腺病毒载体疫苗rAd/E2的构建及鉴定

目的构建含丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)E2基因的复制缺陷型重组腺病毒载体疫苗,并进行鉴定。方法以含HCV(1a亚型)E2基因的质粒pEGFP-HCV/E1E2为模板,PCR扩增E2基因,扩增产物与pGEM-T载体连接,测序正确后双酶切亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/E2,Pme I酶切线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组,获得重组腺病毒质粒pAd/E2,PacⅠ酶切线性化后,脂质体LipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞进行包装,获得重组腺病毒rAd/E2,在HEK293细胞内扩增,利用报告基因GFP的表达监测病毒包装及感染效率,PCR、RT-PCR和Western blot对重组腺病毒进行鉴定,并测定各代病毒的滴度。结果测序结果证明HCV E2基因序列正确;重组腺病毒质粒pAd/E2经酶切证明重组成功;PCR、RT-PCR及Western blot结果均证实重组腺病毒rAd/E2构建正确;第4代重组腺病毒的滴度为7.5×108 pfu/ml。结论已成功构建了重组HCV腺病毒rAd/E2,为丙型肝炎疫苗的研制提供了新的途径。     

牙本质基质蛋白1功能片段的融合表达及其胞内定位

目的构建含单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点不同碱基的37 kD的N-牙本质基质蛋白1(Dentin matrix protein 1,DMP1)和全长DMP1基因重组表达质粒,并分析重组蛋白在HEK293细胞中的表达及定位。方法利用定点突变改造DMP1基因,获得DMP1基因的SNP rs10019009的不同基因型,将含SNP位点不同碱基的37 kD N-DMP1和全长DMP1基因定向克隆入含增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的质粒pcDNA3.1-EGFP中,构建重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP,通过脂质体法瞬时转染HEK293细胞,荧光显微镜观察重组融合蛋白DMP1-EGFP的表达及胞内定位。结果 DNA测序结果表明,定点突变后的DMP1基因的碱基序列与设计序列完全一致;PCR和DNA测序显示重组质粒pcDNA3.1-DMP1-EGFP构建正确;融合蛋白DMP1-EGFP在HEK293细胞中主要表达于细胞胞浆中。结论成功构建了含rs10019009-SNP位点不同碱基的37 kD的N-DMP1和全长DMP1基因重组表达质粒,并在HEK293细胞的胞浆中有效表达,为进一步研究DMP1基因的功能奠定了基础。     

人巨细胞病毒糖蛋白gB基因重组腺病毒载体的构建及包装

目的构建携带有人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白gB基因的重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中进行包装。方法将gB基因克隆至穿梭质粒Track-CMV,构建重组质粒Track-CMV/gB,亚克隆至转移载体pAD-Easy-1,构建重组质粒pAD-Easy-1/gB,将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用HEK293细胞产生重组腺病毒。空斑法及PCR法挑选重组病毒,荧光显微镜观察标志蛋白(绿色荧光蛋白)的表达,利用噬斑法检测病毒滴度。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,转染重组腺病毒载体的HEK293细胞经PCR扩增,可见约700bp的目的基因片段,荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达,空斑试验检测病毒滴度为2×106PFU/ml。结论已成功构建了含有gB基因的重组腺病毒载体,为进一步研制重组腺病毒载体HCMV疫苗提供了条件。     

HIV-1 DNA疫苗的构建及免疫原性

目的构建稳定表达HIV-1Gag-Pol蛋白的DNA疫苗,提高目的基因的表达效率。方法对HIV-1野生型Gag-Pol基因序列进行优化,使用本室构建的表达载体VR,构建重组质粒VR-GPCINS。将构建的重组质粒VR-GPCINS转染HEK293细胞,Western blot鉴定表达产物。用构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,Western blot检测体液免疫反应。结果成功构建能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的VR-GPCINS质粒,Western blot在免疫小鼠的血清中检测到抗p24的特异性抗体。结论含优化Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GPCINS在细胞表达和体液免疫方面均明显优于含野生型Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GP。     

应用AdMax系统构建携带HCV核心基因Core的重组腺病毒载体

目的应用AdMax系统构建携带丙型肝炎病毒(HCV)核心基因Core的重组腺病毒载体,为进一步研究防止HCV感染的基因疫苗和基因治疗奠定基础。方法RT-PCR法从丙型肝炎患者血清中扩增HCVCore基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-Core,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pAd-Core,经HEK293细胞扩增后,离子交换柱层析法纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度,并计算比活性及单细胞产量。结果重组腺病毒pAd-Core感染的HEK293细胞经PCR检测,可扩增出HCV核心基因Core片段,经测序证明,其插入序列与设计的HCV Core基因序列一致。扩增纯化后,重组腺病毒的比活性达0.034IU/VP,单细胞产量可达2.63×104VP/细胞。结论已成功构建重组腺病毒载体pAd-Core,为Core基因在腺病毒介导下的基因免疫和基因治疗的研究奠定了基础。