四川地区宫颈癌患者组织中部分高危HPV亚型感染及E6基因序列分析

目的调查四川地区宫颈癌患者组织中高危人乳头瘤病毒(HPV)33、52和58亚型的感染状况及E6基因突变特性,为制备适合中国人群的HPV疫苗提供流行病学资料。方法采用PCR技术,并结合基因测序分析。结果对四川地区2003~2004年60份宫颈癌患者癌组织DNA进行HPV检测,获得HPV52和HPV58亚型各4份,检出率为6·7%;HPV33亚型1份,检出率为1·7%。对所获得的各份HPV33、52和58E6基因测序,均有碱基突变。结论HPV52型感染率在四川地区相对较高。与GenBank标准株相比,四川地区发现的HPV33和HPV52E6基因有多处突变,与日本发现的HPV33和HPV52突变株相近。     

妇女子宫颈感染人乳头瘤病毒高危亚型HPV52的遗传变异性分析

目的了解宁波地区人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)高危亚型HPV52的分布和癌相关基因E6、E7区基因变异情况。方法收集宁波市社区妇女的宫颈脱落细胞样本进行HPV分型检测,并对其中HPV52亚型阳性株进行癌相关基因测序和序列分析。结果从778份样本中检出HPV52阳性24例,检出率为3.1%。获得E6、E7基因序列分别为21和19条。E6区有3个位点发生碱基颠换:G350T、G356A和A379G,其中G350T和A379G出现率最高,占95.2%;E7区有3个位点发生碱基颠换:C751T、A801G和A849C,其中C751T和A801G出现率最高,占94.7%。系统进化树分析显示,宁波地区HPV52型存在亚洲型和欧洲型。结论宁波社区人群HPV52感染率较高,多数感染者携带病毒的癌相关基因发生变异,应加强对人群HPV感染状况和病毒株变异情况的监测,及时调整宫颈癌防治策略。     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1基因重组MVA病毒的构建及鉴定

目的研制预防人乳头瘤病毒(HPV)感染的重组修饰的Ankara痘病毒(MVA)活载体疫苗。方法将HPV16L1基因插入MVA病毒转移载体psc11M2的P7·5启动子的下游,构建转移质粒psc11M2-L1,与MVA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),进行同源重组。通过9轮蓝斑筛选,以PCR和Westernblot鉴定重组病毒。结果获得的含目的片段的重组MVA病毒,表达产物与鼠抗人HPV16L1抗体发生阳性反应,目的蛋白相对分子质量约为55000。结论已成功地构建了可正确表达HPV16L1基因的重组MVA病毒株。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白VLP的原核表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白病毒样颗粒(VLP),并进行纯化,为研制宫颈癌疫苗提供新的思路。方法以HPV16基因组DNA为模板,PCR扩增HPV16L1基因的编码区,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)编码区下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用GST纯化柱纯化重组融合蛋白,并用凝血酶切去GST标签,再经S100分子筛纯化,浓缩后,电镜观察纯化蛋白的VLP形态。结果重组表达质粒经双酶切和测序,证明构建正确。表达产物的相对分子质量约为80000,主要以可溶性形式存在。Western blot显示,目的蛋白可与小鼠抗HPV16L1抗体发生特异性反应。纯化蛋白的纯度约为95%,在电镜下可见直径约为50～60nm的VLP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性的HPV16L1蛋白VLP,并进行了纯化,为宫颈癌疫苗及血清学诊断试剂的研制奠定了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1/E7嵌合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的克隆人乳头状瘤病毒16型(HPV16)L1/E7嵌合蛋白基因,并在毕赤酵母中表达。方法PCR扩增HPV16L1/E7基因,并克隆至毕赤酵母表达载体pPIC-3·5K和pPIC-9K中,构建含HPV16L1/E7基因的pPIC3·5K-HPV16L1/E7和pPIC9K-HPV16L1/E7重组表达载体,经测序证实插入的外源基因读码框正确后,分别转入GS115和KM71菌株中,筛选阳性转化菌株,经PCR鉴定,甲醇诱导表达HPV16L1/E7嵌合蛋白,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定,电镜观察,并经离心法纯化VLPs。结果HPV16L1/E7基因已成功插入pPIC-3·5K和pPIC-9K载体中,共获得6株KM71HPV16L1/E7-pPIC3·5K、5株GS115HPV16L1/E7-pPIC3·5K、1株KM71HPV16L1/E7-pPIC9K和2株GS115HPV16L1/E7-pPIC9K阳性转化菌株,并可表达相对分子质量约为69000的蛋白,与预期值一致。表达量约为0·35~1·04mg/ml。Westernblot显示该蛋白可与抗-HPV16L1蛋白和抗-HPV16E7蛋白的单克隆抗体特异性结合。在透射电镜下可观察到VLPs的形成,其形态与HPV16天然病毒颗粒相似。经纯化的目的蛋白纯度接近100%。结论已成功构建了pPIC3·5K-HPV16L1/E7和pPIC9K-HPV16L1/E7重组表达载体,阳性转化菌株可表达结构与野生型HPV16一致的VLPs。     

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒的特征分析

目的对人乳头瘤病毒18型(human papilloma virus 18,HPV18)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)进行特征分析。方法采用质谱技术分析HPV18 VLPs(重组大肠埃希菌表达系统表达L1蛋白,自组装成为VLPs)蛋白质一级结构,圆二色谱技术分析蛋白质二级结构,高效液相色谱、透射电镜和动态光散射技术分析蛋白质三级和四级结构;同时采用假病毒中和试验分析HPV18 VLPs的免疫原性,SDS-PAGE法分析样品纯度。结果HPV18 VLPs蛋白翻译后修饰主要包括氧化和去酰胺化,完整L1单体分子量约56 000;二级结构中螺旋、折叠、转角、不规则卷曲的比例分别为8. 4%、46. 1%、18. 5%、30. 2%;颗粒纯度达99%以上,且形态饱满完整,大小均一,直径约60 nm。HPV18 VLPs诱导小鼠产生中和抗体滴度的几何均值达3 000以上。HPV18 VLPs中完整L1单体含量达95%以上。结论 HPV18 VLPs结构完整,颗粒大小均一,纯度高,免疫原性良好,本研究为宫颈癌疫苗安全性和有效性的评价奠定了基础。     

人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期蛋白L1 DNA疫苗的免疫原性及安全性

目的对HPV18型DNA疫苗的免疫原性和安全性进行初步评价。方法将HPV18L1基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建DNA疫苗质粒pcDNAL1。使用脂质体将重组质粒转染COS7细胞,用Westernblot检测体外瞬时表达的抗原。将重组质粒pcDNAL1肌肉注射BALBc小鼠(100μg只),加强免疫3次后分别采集血清,用ELISA法和Westernblot法检测抗体,实时荧光定量PCR法检测质粒的组织分布。采用ELISA法检测DNA疫苗免疫后抗核抗体和抗双链DNA抗体的效价。结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达HPV18L1蛋白。小鼠免疫后可检出较高滴度的抗HPV18L1抗体和特异条带。免疫后质粒主要分布在注射部位,且随着时间延长被清除;未检测到抗核抗体和抗双链DNA抗体。结论HPV18L1重组质粒可诱导小鼠产生特异的体液免疫反应,且该DNA疫苗是安全的,为进一步研制开发HPVDNA疫苗打下了基础。     

人乳头瘤病毒16型L1 N-端主要抗原基因的原核表达

目的　获得序列正确的人乳头瘤病毒 (HPV) 16型L1N -端主要抗原基因 ,构建其原核表达载体 ,并进行诱导表达。方法　采用PCR法从宫颈癌组织中获得HPV16型L1N 端主要基因重组表达质粒 ,转化E .coliDH5α ,4 2℃诱导表达 ,Westernblot分析表达产物。结果　获得了序列正确的人乳头瘤病毒HPV16型L1N -端主要基因 ,相对分子质量约为 5 10 0 0。表达蛋白能与乳头瘤病毒抗体及乳头瘤病毒感染患者的血清发生抗原抗体反应。结论　已成功构建HPV16型L1N -端主要基因表达载体 ,并获得有效表达。     

人乳头瘤病毒治疗型疫苗的研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)感染是导致尖锐湿疣的主要原因,约有90%的生殖器疣由HPV6、11型引起。我国妇女宫颈癌组织中HPV感染率大于95%,其中HPV16、18型占90%以上。随着对HPV及其致病机理研究的深入和免疫学的发展,利用免疫学方法治疗HPV引发的疾病显示出极大的应用前景。本文就人乳头瘤病毒治疗型疫苗的研究进展作一综述。     

沉默E6相关蛋白对人乳头瘤病毒阴性宫颈癌细胞中p53蛋白表达水平的影响

目的 探讨沉默E6相关蛋白(E6-associated protein,E6AP)对人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)阴性宫颈癌细胞(C33A)中p53蛋白表达水平的影响。方法 在LipofectamineTM2000转染试剂的介导下，将特异性沉默E6AP的siRNA序列(siE6AP)及沉默对照无序siRNA序列(siControl)分别转染C33A细胞。Western blot法检测siRNA对E6AP的沉默效果及细胞中p53和cleaved-caspase-3蛋白的表达水平。结果 siE6AP组C33A细胞中E6AP蛋白表达水平显著低于siControl组(t=-4.597,P<0.05)。siE6AP组C33A细胞中p53和cleaved-caspase-3蛋白表达水平均显著高于siControl组(t分别为4.533和7.099,P均<0.05)。结论 沉默E6AP可显著提高C33A细胞中p53蛋白的表达水平，表明沉默E6AP可能恢复C33A细胞中p53的活性和功能。     

野生型着丝粒蛋白-E基因沉默对人结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响

目的利用RNA干扰技术下调野生型着丝粒蛋白E(Wild type centromere protein E,CENP-EWT)基因的表达,观察CENP-EWT基因沉默对结肠癌HCT116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。方法将HCT116细胞分为空白对照组、空载体转染组和CENP-EWT shRNA转染组,转染48 h后,采用巢式PCR检测细胞中CENP-EWT基因mRNA的转录水平;MTT法检测细胞的增殖活力;Hoechst法检测细胞的凋亡比例;Transwell小室试验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果与空白对照组和空载体转染组相比,CENP-EWT shRNA转染组可有效抑制CENP-EWT基因的转录水平(P<0.05);CENP-EWT shRNA转染组细胞的增殖活力明显下降(P<0.05);细胞凋亡比例明显增加(P<0.01),细胞的迁移和侵袭能力明显增强(P<0.01)。结论 CENP-EWT基因沉默能够抑制人结肠癌HCT116细胞增殖,诱导细胞凋亡,但同时能增强细胞的迁移和侵袭能力。     

人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备

目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价。结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致;重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确;表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85%,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000。结论成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础。     

人肺癌ILK基因siRNA重组表达质粒的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的构建人肺癌整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)基因siRNA重组表达质粒,并检测其对人肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法人工合成靶向ILK基因的siRNA干扰序列,克隆至载体pGenesil-1中,构建重组表达质粒pGenesil-1-ILK,利用脂质体转染A549细胞,经G418稳定筛选后,采用RT-PCR和Western blot检测细胞中ILK基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平,MTT法检测细胞的增殖活力。结果重组表达质粒pGenesil-1-ILK经SalⅠ单酶切及测序证明构建正确,其转染A549细胞后,细胞ILK基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),且细胞的增殖能力也显著降低(P<0.05)。结论成功构建了人ILK基因siRNA重组表达质粒,ILK基因沉默可显著抑制A549细胞增殖,为肺癌靶向基因治疗的研究提供了新的思路。     

RNA干扰整合素连接激酶基因表达对人舌鳞癌Tb细胞生长、迁移和侵袭能力的影响

目的探讨沉默整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)基因表达对人舌鳞癌Tb细胞生长、迁移和侵袭能力的影响。方法将ILK siRNA表达质粒和阴性对照质粒在脂质体介导下转染人舌鳞癌Tb细胞,稳定表达细胞株分别命名为Tb siILK和Tb vector组,并设正常Tb细胞对照组(Tb组)。Western blot法检测细胞中ILK蛋白的表达;细胞免疫荧光法检测细胞中ILK、p-Akt和p-GSK3β的表达;光镜和HE染色观察细胞的形态学变化;划痕试验检测细胞的迁移能力;Transwell法检测细胞的侵袭能力;流式细胞术检测细胞的细胞周期和凋亡情况;MTT法检测细胞的增殖活力;Western blot法检测沉默ILK基因后细胞中p-Akt、Akt、p-GSK3β、GSK3α/β、Snail的表达。结果与Tb和Tb vector组相比,Tb siILK组细胞中ILK蛋白的表达水平显著降低(P<0.01);ILK、p-Akt、p-GSK3β在胞质中的荧光信号明显减弱;大部分细胞的上皮形态特征更为明显;细胞的迁移距离和侵袭细胞数显著减少(P<0.05);G2-M期和G0-G1期细胞比例均显著增加(P<0.01);细胞的增殖活力显著减低;ILK基因沉默后,细胞中p-Akt、p-GSK3β和Snail蛋白的表达水平显著降低(P<0.05)。3组细胞的凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。结论抑制ILK基因的表达可通过Akt/GSK3β/Snail途径显著抑制人舌鳞癌Tb细胞的生长、迁移和侵袭能力,ILK有望作为治疗人舌鳞癌的靶基因。     

Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的观察凋亡抑制蛋白Survivin基因干扰和过表达对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响。方法将Survivin基因shRNA干扰质粒和过表达质粒pcDNA3.1-GFP-Survivin在脂质体介导下转染MCF-7细胞,并设空白对照组和脂质体对照组,转染后48 h,荧光显微镜下观察转染效率;荧光定量RT-PCR法检测转染细胞中Survivin基因mRNA的转录水平;MTT法检测转染细胞的凋亡率。结果转染MCF-7细胞后48 h,Survivin基因RNAi质粒和过表达质粒的转染效率为50%～60%;shRNA质粒转染组MCF-7细胞中Survivin基因mRNA的转录水平明显低于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显高于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05);shRNA质粒转染组MCF-7细胞的凋亡率明显高于空白对照组和脂质体对照组,而过表达质粒转染组明显低于空白对照组和脂质体对照组(P<0.05)。结论 Survivin基因对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡具有一定的抑制作用,可作为人乳腺癌生物治疗的候选基因。     

RNA干扰her-2基因对骨肉瘤细胞血管内皮生长因子-A和白细胞介素-8表达的影响

目的探讨her-2基因沉默对人骨肉瘤细胞株saos-2中血管内皮生长因子-A(Vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)和白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)表达的影响。方法构建her-2 shRNA重组表达质粒,转染至骨肉瘤细胞株saos-2,同时设空白对照组和shNC阴性对照组;RT-PCR检测her-2、VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平;Western blot检测her-2蛋白表达的变化;ELISA法检测细胞培养液中VEGF-A和IL-8的分泌水平。结果构建的her-2 shRNA表达载体能抑制her-2基因的表达,对her-2基因mRNA的转录和蛋白表达的抑制率分别为63.05%和62.59%;转染重组质粒her-2 shRNA后VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平及蛋白分泌水平均显著降低(P<0.01)。结论 her-2基因沉默后,VEGF-A和IL-8基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平明显降低,her-2基因参与了骨肉瘤细胞VEGF-A和IL-8基因的表达调控,提示her-2基因可作为研究骨肉瘤血管生成分子机理的新靶点。