注射用重组人干扰素β1b规模化分离纯化工艺的建立及其产品质量的检定

目的建立注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)规模化纯化工艺,并对该工艺制备产品的质量进行检定。方法采用高压均质机对rh IFNβ1b/BL21菌体进行破碎,离心提取包涵体,经有机抽提及酸化沉淀获得粗制rhIFNβ1b;通过Sephacryl S-200和Sephadex G-25层析纯化获得rhIFNβ1b原液,连续生产3批。将原液稀释,加入保护剂,经分装、冻干制备成品。同时对原液及成品的质量进行检定。结果 3批rhIFNβ1b原液蛋白产量可达6~7 g,平均回收率可达15.1%,平均效价为1.1×10~7 IU/mg,HPLC纯度和SDS-PAGE纯度均超过97%,一级序列和二级结构具有良好的一致性。每批rhIFNβ1b原液可制备出20 000~30 000支成品,且各项检定项目均合格。结论建立了rhIFNβ1b规模化分离纯化工艺,制品的产量、纯度及活性均较高,符合rhIFNβ1b工业化生产的要求。     

生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a的CHO细胞工艺的建立

目的建立生物反应器培养分泌重组人干扰素β1a(IFNβ1a)的CHO细胞的工艺,探讨CHO细胞表达分泌IFNβ1a的反应动力学规律。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体方式培养CHO工程细胞,比较不同时期细胞的生长形态、数量、生物活性、灌流量、葡萄糖消耗量及其他物理参数的变化规律。结果 15 L生物反应器中在初始pH 6.86～7.20,溶氧30%～70%,温度36.8～37.2℃,微载体4 g/L,罐流量6.5 L/h的条件下连续培养40 d,CHO工程细胞的密度维持在5×105个/ml之间,收获的细胞液中重组人IFNβ1a的生物活性为2.5×104～4.0×105IU/ml,葡萄糖消耗量在0.5～2.5 mg/ml之间。结论初步建立了15 L生物反应器培养分泌重组人IFNβ1a的CHO细胞的工艺,为进一步建立工业化生产工艺奠定了基础。     

重组人干扰素-β(rhIFN-β)中试工艺研究

目的　建立适合大规模生产重组人干扰素 β(rhIFN β)的分离纯化工艺。 方法　采用超声破菌、离心分离包涵体、仲丁醇萃取、Sephacryl 10 0、HIC层析等分离纯化步骤。结果　纯化的rhIFN β纯度达 98%以上 ,比活性为 2 .0× 10 7IU/mg,各项质量指标均符合质控标准。结论　此纯化工艺简便 ,可重复性好 ,适于大规模生产。     

重组人干扰素β1b活性测定国家标准品的研制

目的研制重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)生物学活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhIFNβ1b标准品原液各项质量指标,以rhIFNβ1b国际标准品为标准进行协作标定,并检测其稳定性。结果rhIFNβ1b国家标准品经检测,外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%,分装精度为0.44%。该标准品经3家实验室协作标定24次,几何平均生物学活性为7.18×104IU/支,平均生物学活性的95%可信区间为6.87×104～7.52×104IU/支,单次测定的95%参考值范围为5.76×104～8.68×104IU/支,平均可信限率为4.36%。在温度为-20、4、25和37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论该批rhIFNβ1b活性测定国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,生物学活性定为7.2×104IU/支,批号为08/01。     

重组人干扰素a2a软膏剂的检定及其临床疗效观察

目的 对重组人干扰素a2a软膏的质量进行检定及临床疗效观察。方法 连续试制3批样品进行稳定性试验及生殖器疱疹的临床疗效观察。结果 本品性质稳定，2～10℃保存18个月生物学活性无明显下降，其他各项检定指标均符合质量要求。生殖器疱疹的临床疗效观察，治疗组有效率为85．72％，对照组的有效率为65．27％，差异有显著意义。结论 该制品生产工艺稳定，疗效确切，安全性好。     

重组人干扰素β1a生物学活性MTS/PMS检测方法的建立

目的建立重组人干扰素β1a(Recombimant human interferon beta1a,rhIFNβ1a)生物学活性MTS/PMS检测方法。方法将MTS和PMS偶联作为染色液,建立IFNβ1a生物学活性检测方法,对细胞浓度、细胞病变时间、MTS工作浓度和染色时间进行优化,并绘制效应曲线。对建立的方法进行重复性、准确性验证,并与结晶紫染色法进行比较。结果优化后的MTS/PMS法的最佳反应条件为:细胞浓度1×105个/ml,细胞病变时间24～36 h,MTS工作浓度2 mg/ml,染色时间40 min;A570/630值与IFNβ1a保护Wish细胞S型效应曲线的相关系数(R2)均达0.99以上。不同检测板、相同加样位置的变异系数在6%～20%之间;相同检测板、不同加样位置的变异系数在13%～17%之间;检测IFNβ1a细胞收集液的回收率在86%～121%之间。该法检测rhIFNβ1a生物学活性效应曲线呈反"S"型,线型较好,R2值均在0.99以上,均比结晶紫染色法的R2值高,且比结晶紫染色法更稳定。结论已建立了rhIFNβ1a生物学活性MTS/PMS检测方法,适用于常规定量测定rhIFNβ1a的生物学活性。     

重组人干扰素γ的分子结构及其生物活性

目的 了解重组人干扰素γ的分子结构及其生物活性。方法 采用细胞病变抑制法，以日本干扰素γ参考品为标准，计算国际单位。以4种不同方法检测相对分子质量。结果 比活性≥3．0×107 IU/mg蛋白，相对分子质量低于理论值16900。氨基酸分析结果只有129个氨基酸，少于应有数目。N端氨基酸序列分析结果，15－19个氨基酸与理论序列相符。结论 重组人干扰素γ C末端氨基酸有缺失，但不影响其生物活性。     

不同分子量聚乙二醇单修饰重组人干扰素a-2a

利用N-羟基琥珀酰亚胺活化制备不同分子量的聚乙二醇修饰剂(NHS-mPEG，分子量5000, 10000, 20000)，考察三者水解动力学性质的差异，结合正交实验确定了不同分子量修饰剂制备单条PEG链修饰重组人干扰素a-2a(rhIFN-a-2a)的最佳反应条件，用离子交换法对产物进行分离纯化. 研究了不同分子量聚乙二醇干扰素结合物的体外活性，比较其蛋白收率. 实验结果表明，修饰剂分子量增大，应选择蛋白与修饰剂的反应活性高的修饰反应条件，体外活性虽然降低，但同时单修饰聚乙二醇干扰素结合物收率更高，产品质量更易控制.     

重组人干扰素β1b治疗复发缓解型多发性硬化症的安全性及临床疗效

目的观察重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)治疗复发缓解型多发性硬化症(RRMS)的安全性及临床疗效。方法选择20名健康志愿者,分为1.5、3、6和9MIU4个剂量组,每天按剂量皮下注射1次rhIFNβ1b,连续注射8d,观察药物的安全性、耐受性和药代动力学。选择101例RRMS患者,随机分为观察组(52例)和对照组(49例),每周3次分别注射6MIU的rhIFNβ1b和25mg人血白蛋白,用药1年后,2组均注射6MIU的rhIFNβ1b,每周3次,用药1年。定期随访并进行各项指标及核磁共振成像(MRI)检查,观察药物的临床疗效,同时进一步观察安全性。结果安全性观察显示,rhIFNβ1b在9MIU剂量范围内耐受性良好。观察组和对照组分别注射rhIFNβ1b后,可显著减少RRMS患者头部与脊髓中病灶数量或缩小病灶体积,并显著降低复发率,且随着用药时间的延长,效果更加明显。结论rhIFNβ1b安全性和耐受性良好,临床影象学评价疗效显著。     

重组人干扰素α_(2a)软膏剂的检定及其临床疗效观察

目的　对重组人干扰素α2a软膏的质量进行检定及临床疗效观察。方法　连续试制 3批样品进行稳定性试验及生殖器疱疹的临床疗效观察。结果　本品性质稳定 ,2～ 10℃保存 18个月生物学活性无明显下降 ,其他各项检定指标均符合质量要求。生殖器疱疹的临床疗效观察 ,治疗组有效率为 85 .72 % ,对照组的有效率为 6 5 .2 7% ,差异有显著意义。结论　该制品生产工艺稳定 ,疗效确切 ,安全性好     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α1b的制备及其性质

目的制备聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素α1b(rhIFNα1b),并分析其部分性质。方法采用PEG修饰rhIFNα1b,通过离子交换层析分离纯化修饰混合物,单点修饰产物经超滤浓缩后,经Lowry法检测蛋白的浓度,SDS-PAGE和RP-HPLC检测蛋白的纯度,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点,质谱法检测蛋白的相对分子质量,细胞病变抑制法检测蛋白的体外活性,ELISA法检测蛋白的抗原性。结果单点修饰产物的蛋白得率为33%;SDS-PAGE分析纯度为96.1%,RP-HPLC分析纯度为98.1%;等电点为6.22;相对分子质量为39946;比活为1.28×106IU/mg,活性保留率为14.4%;抗原性至少降至原来的1/625。结论制备的单点修饰rhIFNα1b药学性质获得改善,有望开发为安全、长效的新型干扰素。     

rhIFN-β1a cDNA在CHO细胞上的表达

目的　在CHO细胞上表达rhIFN βcDNA。 方法　利用脂质体技术 ,将含hIFN β基因的pRC CMV IFNβ DNA载体和pSV2dhfr DNA质粒按 3∶1的比例转染CHO k1dhfr 细胞 ,后者是选择性标记。筛选在缺乏胸腺嘧啶的选择培养基生长的单个细胞克隆 ,通过MTX加压扩增与dhfr基因共转染IFNβ基因。筛选的细胞株通过大规模培养 ,收集培养液经一系列的步骤纯化。结果　能够耐受 0 .6 μmol LMTX的细胞可产生IFN 10 5unitperday 10 6cells ,CHO细胞中表达的hIFN β纯化后的抗病毒比活性可达 2 .2× 10 8IU mg。结论　建立了适合表达人干扰素 β的CHO细胞株     

重组人干扰素βSer~(17)的制备及其对SARS病毒的抑制作用

目的制备重组人干扰素-βSer17(rhIFN-βSer17),并检测其对SARS病毒的抑制作用。方法通过发酵收集菌体,经高压匀浆破碎收集包涵体、有机溶剂抽提、酸沉淀、柱层析纯化重组蛋白,通过细胞病变抑制法检测其对SARS病毒的抑制作用。结果研制的rhIFN-βSer17的纯度超过95%,比活性超过2.0×107IU/mg蛋白,在体外对SARS病毒具有明显的抑制作用。结论已成功制备rhIFN-βSer17,并在体外对SARS病毒具有抑制作用。     

重组人干扰素βSer17的制备及其对SARS病毒的抑制作用

目的制备重组人干扰素-βSer17(rhIFN-βSer17),并检测其对SARS病毒的抑制作用.方法通过发酵收集菌体,经高压匀浆破碎收集包涵体、有机溶剂抽提、酸沉淀、柱层析纯化重组蛋白,通过细胞病变抑制法检测其对SARS病毒的抑制作用.结果研制的rhIFN-βSer17的纯度超过95%,比活性超过2.0×107 IU/mg蛋白,在体外对SARS病毒具有明显的抑制作用.结论已成功制备rhIFN-β Ser17,并在体外对SARS病毒具有抑制作用.     

人β-NGF蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

目的在大肠杆菌中表达人神经生长因子β(β-NGF)蛋白,并进行纯化及生物活性检测。方法以人外周血基因组DNA为模板,PCR扩增人β-NGF基因片段,克隆并测序后,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a-β-NGF,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。采用分子筛层析法对表达产物进行纯化,复性后用鸡胚背根神经节培养试验检测其生物活性。结果酶切和测序证实,PCR扩增的人β-NGF基因片段为β-NGF成熟肽编码序列;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的23.5%,主要以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达90%以上,表达量为4.8mg/L菌液,且可明显促进鸡胚背根神经节神经突起生长。结论已在大肠杆菌中成功表达了人β-NGF蛋白,纯化后的重组蛋白具有良好的生物活性。     

重组人凝血因子Ⅸ在CHO细胞中的表达和纯化

目的在CHO细胞中表达并纯化人凝血因子Ⅸ(human coagulation factorⅨ,hFⅨ)。方法将高表达hFⅨ的CHO细胞株在摇瓶中用无血清培养基进行批次培养和补料批次培养,收获补料批次培养上清,通过阴离子交换层析进行纯化,测定纯化产物的蛋白浓度及hFⅨ活性,并进行SDS-PAGE分析。结果批次和补料批次培养表达的hFⅨ活性分别高达0. 62和14. 45 IU/mL。纯化后的h FⅨ比活性高达157. 19 IU/mg。SDS-PAGE分析表明重组CHO工程细胞株能正确表达hFⅨ。结论成功在CHO细胞中表达并纯化了高比活性的重组hFⅨ蛋白,为进一步研制重组FⅨ药物奠定了基础。     

重组人干扰素α2a栓剂对慢性盆腔结缔组织炎的疗效

目的 应用重组人干扰素a     

重组人红细胞生成素制品中CHO细胞蛋白残留量的测定

本文报告了重组人红细胞生成素制品中CHO细胞蛋白残留量测定方法（ELISA）的研究和建立。该方法具有较高的灵敏度、重复性、重显性和良好的实验相关性。对国产的22批重组人红细胞生成素半成品进行检定,合格率为81．8％。     

重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶软膏治疗尖锐湿疣

目的观察重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶乳膏治疗尖锐湿疣的效果。方法将120例尖锐湿疣病例分为治疗组60例和对照组60例,治疗组采用5%氟尿嘧啶联合干扰素治疗,对照组单纯采用5%氟尿嘧啶治疗。结果以随访3个月为限,治疗组治愈率为96.7%,高于对照组的80.0%,P<0.01。结论重组人干扰素a1b联合5%氟尿嘧啶乳膏治疗尖锐湿疣能明显提高治愈率。