2019年云南省昆明市柯萨奇病毒A组16型毒株的分离鉴定及其VP1基因遗传特征分析

目的 对2019年云南省手足口病（hand,foot and mouth disease,HFMD）患者粪便中分离获得的柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CVA16）毒株的全VP1基因遗传特征进行分析。方法 使用人胚肺二倍体KMB-17细胞和非洲绿猴肾Vero细胞分离病毒,设计针对CVA16全VP1基因序列引物,采用RT-PCR扩增目的基因片段并测序;利用MEGA 7.0和Geneious 9.0.2等软件对全VP1序列进行分析。结果 共分离获得26株CVA16毒株,其中有8株KMB-17分离株和18株Vero分离株。随机选取20株CVA16分离株进行分析,发现3株B1a和17株B1b基因亚型;其中17株CVA16 B1b分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.8%～100%和98.3%～100%,与国内其他分离株的核苷酸和氨基酸同源性为91.1%～99.2%和97.3%～99.0%;3株B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为98.0%～98.1%和99.3%,与国内其他B1a分离株的核苷酸和氨基酸同源性为88.7%～98.7%和98.3%～99.7%;17株B...     

肠道病毒71型甘肃分离株VP1基因特征分析

目的分析肠道病毒71型(Enterovirus,EV71)甘肃分离株VP1基因的特征。方法应用RT-PCR法扩增4株EV71甘肃分离株(46F、47F、51F和55F)的VP1基因,克隆入pTA2载体,进行核苷酸序列测定,并进行序列的同源性比较及进化树分析。结果 4株病毒VP1核苷酸序列长度均为891bp,推导的氨基酸序列含297个氨基酸。51F与55F毒株核苷酸和氨基酸同源性均为100%,46F与47F的同源性分别为99.6%和99.0%,4株病毒与EV71的C4亚型毒株核苷酸同源性在96%以上,氨基酸同源性在99%以上。同源性和进化树分析显示,4株分离株分属2个群,其中51F和55F毒株同属一个群,其与昆明分离株kunming41-08亲缘关系最为相近;46F和47F同属一个群,其与内蒙分离株0723F/NM/CHN/07关系最为相近。结论 4株EV71甘肃分离株属于C4亚型,为中国EV71的基因分型、分子流行病学研究提供了参考。     

肠道病毒71型吉林分离株的全基因组序列分析

目的对2011年吉林省肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)分离株全基因组进行序列分析。方法将手足口病伴发重症脑炎患者的粪便样品接种至Vero细胞,分离EV71;采用RT-PCR法分8段扩增全基因组序列,进行双酶切及序列测定;应用Mega5软件构建EV71系统进化树;通过DNAMAN7和DNASTAR7软件进行EV71分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性比较;经RDP4软件对EV71分离株进行同源重组分析。结果粪便样品接种至Vero细胞2 d后,细胞出现圆缩、透亮、聚堆的病变现象;各PCR扩增产物经双酶切鉴定,均可见与预期大小一致的目的条带;经种系进化树分析显示,EV71分离株属C4a亚型,命名为EV71-JiLin-11-China;其与A、B和C亚型间核苷酸序列的平均同源性分别为22.44%、17.72%和11.96%,与A、B和C亚型间氨基酸序列的平均同源性分别为96.0%、97.2%和97.3%;全基因同源重组分析显示,EV71分离株的165～1 946和7 289～7 366核苷酸区有重组现象,分别源于分离自湖北的C4a-EV71-Hubei-09-China及马来西亚的B4-SB2864-SAR-00和C1-S18062-SAR-98。结论 2011年吉林地区流行的EV71为C4a基因型,为EV71基因特征及流行病学的研究提供了实验依据。     

埃可病毒9型分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征

目的分析2010年昆明市引起手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的病原埃可病毒9型(Echovirus 9,E9)分离株MSH-KM812 VP1基因的遗传特征。方法分别采用RD细胞和Hep-2细胞对3份HFMD患儿粪便标本进行病毒分离,应用RT-PCR法分2段扩增病毒VP1基因,并进行序列测定。应用NCBI BLAST软件对所测定的节段序列进行比对;Omiga软件对所测定的节段序列的核苷酸及推导的氨基酸序列进行编辑、比对和拼接;应用Mega 5.05软件进行序列分析,并与15个E9参考株的VP1基因序列进行比较,构建基因系统进化树。结果从3份HFMD患儿粪便标本中分离到1株E9,命名为MSH-KM812,其VP1区的核苷酸长度为888 bp。MSH-KM812株与其他15个E9参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为78.6%～98.0%和87.5%～99.3%,与中国分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.7%～98.0%和97.0%～99.3%,其中与中国江苏分离株M10MF37 China2010核苷酸和氨基酸序列同源性最高,分别为98.0%和99.3%,而与德国分离株Hill的核苷酸和氨基酸序列同源性最低,分别为78.6%和87.5%。基因进化树分析显示,MSH-KM812分离株与中国江苏分离株M10MF37 China 2010和中国山东分离株05189-SD-CHN-2005-E9属于同一个进化分枝。结论 MSH-KM812分离株为E9,与中国其他分离株同属一个进化分枝。     

新分离5株狂犬病病毒街毒株N和G基因的序列分析

目的分析我国新分离的5株狂犬病病毒(RV)街毒株基因序列及分子流行病学状况。方法采用RT-PCR法从疑似狂犬的犬脑组织内获得N和G基因cDNA的全序列并进行测序,将所得结果与已发表的国内外代表性毒株相应基因进行核苷酸和推导氨基酸序列比较。结果5株均含有完整N基因序列,3株含有完整G基因序列。与国内外发表的部分毒株比较,5株街毒N基因的核苷酸同源性在98.1%～99.9%之间,推导氨基酸同源性在99.5%～100%之间。将5株街毒与人用疫苗株3aG、PV株的N基因进行比较,核苷酸同源性在86.2%～86.7%之间,氨基酸同源性在95.1%～95.5%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在89.4%～89.6%之间,氨基酸同源性在98.2%～98.6%之间。3株街毒G基因的核苷酸同源性在98.5%～99.4%之间,推导氨基酸同源性在99.6%～100%之间。将3株街毒与人用疫苗株aG、PV和兽用疫苗株ERA的G基因进行比较,核苷酸同源性在82.8%～83.1%之间,氨基酸同源性在88.0%～90.1%之间;而与人用疫苗株CTN比较,核苷酸同源性在86.7%～87.1%之间,氨基酸同源性均为92.0%。结论新分离街毒株基因未发生较大变异,与CTN的同源性高于与aG株和PV株。     

吉林省2011年手足口病死亡病例肠道病毒71型分离株全基因组基因特征分析

目的分析吉林省2011年手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)死亡病例标本中分离获得的肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)毒株全基因组基因特征。方法采用分段RT-PCR法对2011年吉林省HFMD死亡病例EV71分离株JL2011-56全基因组进行扩增和测序。利用Clustal X2和MEGA5软件构建分离株JL2011-56与Gen Bank中27株参考株的全基因组序列和VP1区全基因组序列的进化树,分析Jl2011-56株的流行病学特征;同时与Gen Bank中12株C4a基因亚型参考株进行全基因组核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。结果 JL2011-56分离株属于C4a亚型,核苷酸序列和氨基酸序列与山东分离株SDLY107(JX244186.1)同源性最高,分别为99.2%和99.5%,与EV71原型株Br Cr的同源性分别为79.9%和95.7%。结论 JL2011-56分离株与山东株亲缘关系较近,可能存在共同的与中枢神经毒力相关的氨基酸突变位点。     

乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3-Smb53株全基因序列分析

目的对我国乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3株鼠脑53代(P3-Smb53)进行全基因序列测定及分析。方法提取P3-Smb53株病毒全基因组RNA,逆转录合成为cDNA,以其为模板分段进行PCR扩增,并测序;序列拼接后,利用NCBI的Blast程序和DNASTAR软件包中的MegAlign软件与GenBank中登录的5个基因型别的177株乙脑病毒全基因序列、551株乙脑病毒E蛋白序列进行比对。结果 P3-Smb53株病毒基因组全长10 976个核苷酸,与177株乙脑病毒株的全基因序列核苷酸同源性为79.6%~99.7%,氨基酸同源性为91.3%~99.7%;与GenBank中登录的551株乙脑病毒E蛋白氨基酸同源性为91.0%~99.8%,在E蛋白12个关键抗原性位点中,所有毒株均非常保守;与GenBank中登录的P3株全基因序列核苷酸同源性为99.4%,氨基酸同源性为99.5%。结论乙型脑炎灭活疫苗生产用毒种P3-Smb53株虽然与不同基因型毒株间的氨基酸差异较大,但在关键抗原位点上高度一致,理论上能够抵抗目前国内外所有乙脑分离株的感染。     

2009年云南省昆明地区柯萨奇病毒B5的遗传特性分析

目的对2009年中国云南省昆明地区柯萨奇病毒B5(Coxsackievirus group B5,CVB5)的部分VP1基因序列进行分析,以了解CVB5的遗传特性。方法收集2009年中国云南省昆明地区临床诊断为无菌性脑炎患儿的200份粪便标本,设计针对CVB的通用引物,利用半巢式RT-PCR扩增部分VP1基因。PCR产物直接测序后,采用Omiga和Mega 5.05等生物学软件进行核苷酸、氨基酸序列及系统进化分析。结果共分离出7株CVB5,其部分VP1基因之间的核苷酸和氨基酸序列同源性均较高,分别为92.7%～98.5%和93.6%～100.0%;与中国其他不同地区参考株的核苷酸序列同源性为80.1%～99.1%,其中与中国山东株98388-SD-CHN-1998同源性较低;与中国其他不同地区参考株的氨基酸序列同源性为84.4%～100.0%,其中与中国河南株CoxB5-Henan-2010和中国山东株98388-SD-CHN-1998之间同源性最低;与其他不同国家参考株比较,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别在77.5%～89.1%和92.1%～96.3%之间;与原型株Faulkner的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.6%～80.9%和92.1%～95.4%。基因系统进化分析显示,分离的7株CVB5属于相对独立的1个分枝,中国流行株除98388-SD-CHN-1998外,构成1个分枝。结论 2009年中国云南省昆明地区CVB5流行株属于相同基因型。     

分离自手足口病和疱疹性咽峡炎患者的柯萨奇病毒A组10型病毒的基因特征及差异分析

目的比较2株分离自手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)和疱疹性咽峡炎(herpangina,HA)患者粪便样品中的柯萨奇病毒A组10型(Coxsackievirus A10,CA10)全基因组差异及基因特征,探讨基因突变可能导致的临床症状差异。方法收集昆明市儿童医院经实时荧光定量PCR检测结果为CA10阳性的HFMD及HA患者粪便样品,在敏感细胞人横纹肌瘤细胞(rhabdomyoma,RD)上培养并分离出CA10。设计特异性引物扩增获得CA10全基因序列,通过BioEdit软件比较分离自HFMD及HA患者的CA10基因序列核苷酸与编码氨基酸之间的差异。从NCBI基因库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载CA10 VP1基因序列作为参考序列,系统进化树分析分离获得的昆明CA10流行株的进化情况及来源。结果分离自HFMD和HA患者的CA10-HFMD和CA10-HA的VP1区域核苷酸同源性为99. 1%,氨基酸同源性为99. 8%,且存在2个非同义突变位点;全基因序列核苷酸同源性为98. 9%,编码区氨基酸同源性为99....     

一株柯萨奇病毒B2分离株的VP1基因序列特征分析

目的分析一株柯萨奇病毒(Coxsackievirus,CV)B2分离株(CVB2)全VP1基因序列特征。方法用RD细胞对10份HFMD疑似患儿的粪便标本进行病毒分离,利用RT-PCR法从分离的病毒中扩增VP1基因,并测序,采用NCBI BLAST、Mega 6.1和Geneious等软件进行序列分析,并构建系统进化树。结果从10份HFMD疑似患儿粪便中分离到一株CVB2,命名为509/YN/CHN/2010,其全长VP1基因的核苷酸长度与其他CVB2一致,均为846 bp。与中国其他分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.0%~95.3%和97.9%~98.9%,而与国外分离株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为81.1%~87.8%和97.9%~98.6%。在进化树上与其他中国分离株分属不同的两个分支,而与M10MG17亲缘关系较近。结论 509/YN/CHN/2010分离株为肠道病毒CVB2,为两个中国分支中的一支。     

安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒的N基因序列分析

目的对安徽省2011年新分离的19株狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)的N基因进行序列分析,并比较其与代表性RABV街毒株及疫苗株之间的差异。方法采集安徽省淮北地区狗肉市场的犬脑组织121份,伤人犬脑组织10份,采用直接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA法检测RABV抗原,并通过颅内接种昆明乳鼠进一步鉴定毒株;RT-PCR扩增分离病毒的N基因,与pMD18-T载体连接测序后,与代表性RABV街毒株及疫苗株的N基因序列进行比对,并进行遗传学分析。结果在送检的131份犬脑组织样品中检出RABV阳性19株,其中伤人犬脑组织阳性率为90%,狗肉市场犬脑组织阳性率为8.26%。19株RABV N基因核苷酸序列同源性为97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性为98.7%～100%;与代表性人用和兽用RABV疫苗株相比,N基因核苷酸序列同源性为85.4%～89.9%,推导的氨基酸序列同源性为94.9%～99.1%,核苷酸序列的变异主要为同义突变。分离的19株RABV在系统进化树上高度聚集,与以往国内分离的代表性街毒株系统进化关系较近,在同一个分支(HN10除外)与我国疫苗株CTN-181株亲缘关系最近,处于同一个亚群。结论从安徽省伤人犬和狗肉市场的犬脑组织中成功分离并鉴定了19株RABV,这些病毒株均属于基因I型RABV,且具有地域性特征。本研究对特定区域RABV的流行及监测具有一定的意义。     

我国流行的4株狂犬病街毒株G基因序列及分子流行病学研究

目的探讨我国流行的狂犬病毒(RV)基因差异,评价现有疫苗的适用性。方法通过RT-PCR并对其产物测序后获得4株RV街毒株的G基因序列以及G与M和L基因的区间序列。利用计算机分析软件比较4株RV与已经发表的毒株的核苷酸和推导的氨基酸序列。结果糖蛋白(GP)完整的编码基因序列长度为1575 bp。GP氨基酸序列同源性明显高于相应的核苷酸序列(除Mokola外),4株街毒与CTN的同源性高于aG株。GP不同区段比较显示,膜外区同源性高于膜内区。G-M区间核苷酸序列长度为5 bp;除广西4外,其余毒株100％同源。GL区间核苷酸序列长度为2,4 bp,越1与肥东同源性为100％。结论4株RV均属于基因I型。广西的毒株之间存在不同的来源。街毒与疫苗株之间基因存在差异。4株RV与SAD-B19进化途径相近,与PV株相差较远。越1与肥东株亲缘关系极近,可能是由同一毒株演化而来。     

武汉地区呼吸道合胞病毒分离株的G蛋白基因遗传特征

目的分析武汉地区人呼吸道合胞病毒(RSV)分离株的G蛋白基因的遗传特征。方法使用不同的特异性引物,对武汉地区2006年分离的9株RSV进行G基因3′末端第2个高变区的序列测定,并进行基因分型和基因亲缘关系分析。结果分离的9株RSV中,33.3%(3/9)为A亚型,属GA2基因型;66.7%(6/9)为B亚型,其中1株属于BA基因型,5株属于GB8基因型。9株RSVG蛋白与原型株核苷酸同源性为84.5%～99.0%,且与原型株相比,在205～230位氨基酸中有5～8个位点氨基酸变异,还存在糖基化位点的改变。结论2006年初在武汉地区存在着由不同RSV株引起的传播链,A、B亚型共循环,B亚型是优势流行亚型;9株RSVG蛋白与原型比较,存在明显的差异。     

鹅细小病毒VP3基因的克隆及序列分析

目的克隆鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)黑龙江各分离株和疫苗株的VP3基因,并进行序列分析,为小鹅瘟的诊断与防治奠定理论基础。方法根据GenBank中登录的GPV B株全基因序列设计1对特异性引物,PCR扩增、克隆VP3基因,并进行测序和同源性分析。结果克隆的VP3基因大小699 bp,编码233个氨基酸;7个分离株的VP3基因核苷酸序列同源性为99.4%～100%,各分离株与疫苗株的核苷酸序列同源性为98.7%～99.3%,与标准B株的核苷酸序列同源性为97.6%～97.7%,与MDPV核苷酸序列的同源性为80.8%～81.7%;各分离株之间亲缘关系较近,其中QTH分离株与疫苗株亲缘关系最近,氨基酸序列同源性为97.8%,其他分离株与疫苗株的亲缘关系相对较远,氨基酸序列同源性为96.6%～97.4%;所有分离株和疫苗株与标准B株亲缘关系相对较远,与MDPV的亲缘关系最远。结论黑龙江省各分离株与疫苗株的核苷酸和氨基酸序列存在一定的差异。     

广西流行的猪瘟病毒株E2基因序列测定及分析

目的对广西流行的猪瘟病毒E2基因进行序列测定及分析。方法应用PCR对15株猪瘟病毒E2基因进行扩增、克隆及测序,利用DNAstar分析软件对所测定的15株毒株与兔化弱毒(HCLV)、石门(Shimen)毒株的相应基因片段进行同源性分析。结果得到长度为1092nt猪瘟病毒E2基因,编码364个氨基酸残基的目的基因片段。广西株与HCLV、Shimen株的核苷酸同源性分别为81.5%～82.8%和82.8%～84.3%,推导的氨基酸同源性分别为87.1%～88.8%和88.5%～89.9%,广西毒株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为92.3%～99.9%和94.8%～100%。广西15株猪瘟病毒E2蛋白上的全部半胱氨酸(Cys)位点均未改变,推测其E2蛋白的抗原结构保持很高的稳定性。但广西毒株中与特定单克隆抗体结合的724、725、729、734和738位的氨基酸发生了变异,这些变异可能导致不完全免疫保护。把所测定的广西15株与国内外已发表的19株病毒相应序列进行比较,建立系统发育树,所比较的34株猪瘟病毒被分为两个群,广西毒株皆属于基因群Ⅱ。结论成功进行了广西流行猪瘟病毒E2基因序列分析,为进一步探讨猪瘟病毒E2蛋白的抗原结构提供了依据。     

狂犬病病毒aG株糖蛋白遗传稳定性及生物信息学分析

目的研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)aG株糖蛋白(glycoprotein,GP)的遗传稳定性,并对GP基因组进行序列测定及生物信息学分析。方法采用RT-PCR法扩增6代次aG株RV(4aGV4、4aGV5、4aGV7、4aGV11、4a-GV15、4aGV18)G区基因,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定序列并进行拼接;测定6代次aG株RV的滴度、荧光滴度和毒力;应用DNAStar和Mega4.0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析,并与我国近期分离且具有地域代表性的RV街毒株进行基因同源性分析。结果 6代次aG株RV GP基因保持高度稳定,未出现核苷酸突变位点;6代次aG株RV的滴度有所不同,但其毒力指标基本一致;RV aG株与我国街毒流行株GP抗原区具有较高的同源性,且膜外区同源性远高于跨膜区及膜内区;aG株RV第147位关键位点氨基酸与街毒流行株该位点不同,其余各关键抗原位点在各毒株间均高度同源;6代次aG株RV关键毒力位点均未出现氨基酸突变,传代稳定,aG株RV与各街毒流行株关键毒力位点均高度同源;aG株病毒信号肽结构与我国多株流行株高度同源,而其GP则与法国巴斯德原株PV2061株及分离自美国的HEP-Flury株高度同源,与我国流行街毒株亦具有较高的同源性。结论 RV aG株GP遗传稳定,且与我国近期分离的街毒株高度同源,本研究为完善该毒株的质量控制及全面评价其在我国的适用性提供了实验依据。