流感病毒中和抗体检测方法的建立及验证

目的建立检测流感病毒中和抗体效价的微量病毒中和法(microneutralization tests,MNT),并进行验证。方法建立改进的微孔板病毒中和法,并对该方法的关键影响因素(不同代次MDCK细胞和细胞培养板边缘效应)以及方法的准确性和精密性进行验证;采用改进的微孔板病毒中和法和血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验分别检测甲型H1N1流感疫苗免疫的血清样本85人份,分析两种方法检测结果的相关性。结果采用改进的微孔板病毒中和法,用不同代次MDCK细胞(25、30、35代)以及在细胞培养板不同位置(边缘孔、非边缘孔)检测相同的血清样本的中和抗体滴度结果相同;该方法准确性和精密性良好;改进的微孔板病毒中和法和HI法测定甲型H1N1流感疫苗免疫后血清抗体效价结果的相关系数为0.81,表明两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性。结论建立的微量病毒中和法可满足流感病毒中和抗体效价检测的要求,可用于评价疫苗的免疫效果。     

流感病毒的裂解、纯化及抗原性研究

［摘 要］目的 研究适于大规模生产的流感病毒裂解剂、裂解和纯化方法。方法 使用不同表面活性剂（Triton X100和去氧胆酸钠）、不同浓度和时间进行裂解，通过电镜进行裂解效果观察。裂解后经密度梯度离心纯化，并进行抗原性试验。结果 Triton X100的裂解效果优于去氧胆酸钠，应用 1．0％ Triton X100裂解 90min效果较好。裂解率达90％以上。裂解后纯化的样品抗原性与进口疫苗类似。结论 该工艺适于流感裂解疫苗大规模生产。     

二乙烯亚胺灭活流感病毒的效果观察

目的观察二乙烯亚胺(BEI)对流感病毒的灭活效果。方法分别使用甲醛和BEI对流感病毒进行灭活试验,通过血凝试验检测二者灭活效果,并确定各自最佳灭活时间。用灭活的病毒液免疫小鼠,检测其抗原性,并用RT-PCR方法分析灭活病毒基因组的完整性。以裂解剂TritonX-100裂解病毒后,分别加入甲醛和BEI灭活,采用单向免疫扩散法检测灭活不同时间病毒液的HA含量。结果BEI灭活36h可将病毒完全灭活;BEI灭活的病毒免疫小鼠较甲醛灭活病毒产生较高的血凝抑制抗体;BEI灭活病毒液经RT-PCR,不能扩增出病毒基因;BEI灭活病毒的HA平均含量比甲醛灭活病毒的HA平均含量略高。结论BEI在灭活流感病毒感染性的同时,能够灭活病毒基因,并较好地保持病毒的抗原性。     

一株牛副流感病毒3型的分离鉴定及系统进化树分析

目的分离鉴定一株疑似为牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)的毒株,并分析系统进化树。方法从内蒙古某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻液中分离一株疑似为BPIV3的毒株,将分离毒株在MDBK细胞上进行增殖,并通过血凝试验及RT-PCR鉴定,同时对其N基因序列进行测定及分析,建立亲缘关系进化树。结果该分离病毒可在MDBK细胞上增殖,且可产生特异性细胞病变,第6代细胞的毒力为10~(7.1) TCID_(50)/100μL,与GenBank中已发表的BPIV3毒株N基因片段的同源性为99. 9%,与序列号为D84095. 1的BPIV3等亲缘性最近。结论本研究获得的分离株为BPIV3,与日本分离株(D84095. 1)同源性较高。     

流感病毒神经氨酸酶及其疫苗的研究进展

流行性感冒(简称流感)是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,据WHO统计,每年季节性流感可造成约65万人死亡,接种疫苗是预防流感最有效的方法.神经氨酸酶(neuraminidase,NA)是流感裂解疫苗的主要抗原之一,可够诱导机体产生NA特异性抗体,该抗体在预防流感病毒感染、抑制病毒扩散、减轻临床症状及增强疫苗效力方...     

两种细胞培养流感病毒的滴度比较

目的探讨甲1(A1)型流感病毒在Vero细胞和MDCK细胞培养的可行性,确定最佳培养条件。方法将流感病毒接种于Vero细胞和MDCK细胞,在含有不同浓度胎牛血清或胰酶维持液中培养,于不同时间收获病毒液,检测血凝素滴度(HA)。结果胎牛血清对病毒的繁殖有明显抑制作用。加入适量胰酶(约5μg/ml)可提高病毒产量。最佳收获病毒时间为72～96h。在MDCK细胞上的病毒HA滴度高于Vero细胞。结论两种组织细胞培养流感病毒结果相近,Vero细胞和MDCK细胞均可用于培养流感病毒。     

乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上增殖条件的优化

目的优化乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖条件。方法以乙型流感病毒感染无血清悬浮培养的MDCK细胞,对培养条件中的MOI(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7)、胰酶终浓度(2. 5、5、7. 5、10、15、20μg/mL)、细胞接毒密度(50×10⁴、100×10⁴、300×10⁴、500×10⁴、700×10⁴个/mL)及病毒收获时间(24、48、72、96、120 h)进行优化。同时对流感病毒在贴壁培养及无血清悬浮培养MDCK细胞上的增殖情况进行比较。结果乙型流感病毒在无血清悬浮培养MDCK细胞上最适增殖条件为:MOI为10^-2、胰酶终浓度为10μg/m L、细胞接毒密度为300×10⁴个/mL、病毒收获时间为72 h。流感病毒在...     

两种方法纯化流感病毒的比较

目的比较两种方法纯化流感病毒的效果。方法取病毒原液,经超滤浓缩后,分别用Sepharose 4FF凝胶层析和蔗糖密度梯度离心法进行纯化,并对纯化产物进行检定。结果层析法的纯度、卵清蛋白及杂蛋白去除率略高于蔗糖密度梯度离心法,而蔗糖密度梯度离心法的病毒回收率优于层析法。结论两种方法均可用于流感病毒的纯化。     

流行性出血热病毒L99株(家鼠型)与国内外其它毒株抗原性的比较

流行性出血热家鼠型（Ⅱ型）病毒L99株分别在小白鼠脑腔和金黄地鼠肾细胞传代适应，再初步纯化，所选出的毒株具有广谱抗原性和较高的毒力滴度。应用鼠脑或细胞毒种感染金黄地鼠肾细胞制成灭活疫苗免疫动物，检测血清中和抗体反应及对野鼠型（Ⅰ型）和家鼠型（Ⅱ型）强毒攻击的保护力，均证明L99疫苗有双向的免疫效果。L99活毒免疫动物血清与不同来源的Ⅰ、Ⅱ型病毒交叉中和反应亦证明L99株对两型病毒有明显的交叉反应，表明L99株病毒对两型病毒具有双向抗原性。     

正交试验设计优化流感病毒纯化工艺

目的通过正交试验优化流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化工艺条件。方法以影响流感病毒纯化效果的蔗糖溶液用量、上样量、超速离心时间及上样速度为试验因素,每因素设3个水平,通过正交试验设计9组试验。每组试验流感病毒浓缩液纯化后获得的样品进行血凝滴度及蛋白含量检测,计算血凝滴度收率和蛋白去除率;根据正交试验血凝滴度收率、R值及K值结果,确定最适纯化工艺参数。采用最适纯化工艺对中试3批流感病毒浓缩液进行纯化。结果正交试验结果表明,影响流感病毒纯化效果因素的重要性依次为超速离心时间、蔗糖溶液用量、上样量、上样速度,最适纯化工艺参数为超速离心时间3 h,30%蔗糖溶液用量500 mL/台,上样量为700 mL/台,上样速度为60 m L/min。3批中试病毒浓缩液纯化后的血凝滴度收率均> 90%,满足工艺需求。结论采用正交试验获得的流感病毒纯化工艺适合于规模化生产。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的原核表达与抗原性分析

目的表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)弱毒株VP2蛋白并检测其抗原活性。方法以IBDV强毒致弱株Gt株基因组RNA为模板,应用RT-PCR方法扩增VP2基因,并将其克隆入pUC18载体,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,将其亚克隆到原核表达载体pET30a中,并经酶切、PCR、测序鉴定,阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)菌,经IPTG诱导后,表达产物用SDS-PAGE及Westernblot检测。结果阳性重组表达质粒转化E.coliBL21(DE3)后,经诱导表达了目的蛋白,表达量占菌体总蛋白的15%。Westernblot检测表达蛋白可与IBDV阳性血清发生反应,而与阴性对照血清不发生反应。结论已成功表达了鸡传染性法氏囊病毒弱毒株VP2蛋白,且具有良好的抗原性。     

近年来广州市二氧化硫的变化特征

近年来,广州市环境管理部门针对二氧化硫污染问题,采取了一系列的防治措施。为了评价这些措施的效果,以2003～2008年SO2监测数据为基础,对广州市二氧化硫浓度的变化趋势及其原因进行了分析。结果表明,广州市环境空气中SO2年日平均浓度呈显著下降趋势。冬季浓度较高,夏季浓度较低。     

戊型肝炎病毒ORF2N-端和C-端多肽的抗原性分析

目的分析戊型肝炎病毒(HEV)ORF2N-端和C-端多肽的抗原性。方法以纯化的4型HEVORF2N-端1～124aa多肽pS4-1和4型HEVORF2C-端385～674aa多肽pS4-6分别包被微孔板,采用间接酶联免疫法(EIA)检测感染HEV的猴系列血清中的抗HEVIgG抗体,分析两种多肽的抗原性,并与进口试剂的检测结果进行比较。结果在感染HEV的猴系列血清中,针对HEVORF2N-端抗原的抗体产生时间早,持续时间短,其峰值与转氨酶(ALT)的峰值几乎重叠;针对HEVORF2C-端抗原的抗体在HEV感染早期产生的滴度较低,但逐渐升高,在14周的观察期内,抗体滴度几乎无下降趋势。用两种多肽检测HEVIgG抗体的灵敏度均高于进口试剂。结论两种多肽均具有较好的抗原性,但在HEV感染的不同时期,其反应性不同。     

生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1的基因分析

目的分析生产用流感病毒H3N2型疫苗株血凝素蛋白HA1基因变异对病毒特性的影响。方法比较2005～2008年间上海生物制品研究所流感病毒H3N2型各疫苗株的生产数据,并对H3N2型各疫苗株的HA1基因序列数据进行分析。结果各疫苗株中,A/NewYork/55/2004(NYMCX-157)的血凝素得率最高,A/Brisbane/10/2007(IVR-147)最低;2006～2007年度疫苗候选株A/Wisconsin/67/2005(NYMCX-161B)的病毒复制能力优于A/Hiroshima/52/2005(IVR-142);各疫苗株的氨基酸差异均未直接涉及到HA1蛋白二硫键组成位点,直接涉及到HA1蛋白抗原决定簇位点、HA1蛋白糖基化位点和HA蛋白受体结合位点的变异分别有3处(140、156和193位)、1处(165位)和1处(225位)。结论2005～2008年间各流感病毒疫苗株血凝素得率因株而异,HA1蛋白抗原决定簇位点变异属于正常的不同毒株间的差异;糖基化位点、二硫键组成位点和受体结合位点基本保守;还需进一步研究部分位点氨基酸变异是否与病毒复制能力密切相关,并探讨改善复制能力的可能性。     

流感病毒重配的研究进展

流感病毒是带包膜、基因组分节段的单股负链RNA病毒。其RNA片段在自然感染过程中发生很频繁的重配,造成病毒抗原性,特别是表面糖蛋白HA和NA抗原性的快速变异,使得病毒逃避机体的免疫监视,导致感染和发病,同时给用疫苗预防免疫带来了困难。利用病毒基因片段自然重配(也称传统重配)的特性或反向遗传学技术,筛选自然基因重配或试验基因重配的流感毒株,获得高滴度、减毒、免疫原性和免疫保护效果好的疫苗毒株,对控制人类或动物流感的暴发和流行具有重要的社会和经济意义。本文对流感病毒的传统重配方法和反向遗传学重配方法及其应用的研究进展作一综述。     

Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养

目的探索Vero细胞和流感病毒在无血清条件下的微载体培养条件。方法在搅拌瓶中,选择合适的微载体,在无血清条件下培养Vero细胞和流感病毒。观察Vero细胞的生长状况,并检测流感病毒的血凝滴度。结果Vero细胞在Cytodex 3上生长最好,每个微载体上接种10个细胞为最佳接种浓度,以MOI=0.005和0.010 CCID50/细胞接种H1N1流感病毒后,在72h时,培养上清病毒血凝滴度达到最高。结论无血清条件下,Vero细胞在Cytodex 3上生长良好,流感病毒能在Vero细胞上成功培养。     

疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰方法的探索

目的探索疫苗毒种支原体检测中去除本病毒干扰的方法。方法分别采用非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法处理21株疫苗毒种样品后,评价去除本病毒干扰的效果。结果21株疫苗毒种中,13株可通过非敏感细胞法去除本病毒干扰;6株可通过特异性抗血清中和法去除干扰;2株可通过离心加中和法去除干扰。应用上述3种方法检测161批疫苗毒种,均能有效去除本病毒干扰。结论非敏感细胞直接接种法、特异性抗血清中和法及离心加中和法可针对不同毒种去除本病毒的干扰,适用于疫苗毒种的支原体检测。