应用原生质体融合技术改善双歧杆菌的耐氧性

利用原生质体融合技术将专性厌氧的短双歧杆菌和典型上面发酵的啤酒酵母进行原生质体细胞融合,通过研究两亲本原生质体的形成与再生,并进行跨界融合,成功初筛出兼具两亲本生物学性状、较稳定的融合子BSF1和BSF2,改善了双歧杆菌的耐氧性。     

双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合子筛选方法的探讨

目的:探讨双歧杆菌(Bifidobacterium)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)原生质体融合子的筛选方法。方法:将双歧杆菌和酿酒酵母原生质体进行原生质体融合,采用10%乳糖中性红培养基进行融合子的初筛,并分析融合子传代稳定性、生物学特性,采用双歧杆菌属特异性寡核苷酸探针对亲本菌和融合子进行了荧光原位杂交检测比较。结果:结果表明,筛选得到的融合子具有双歧杆菌的特异性序列和亲本菌的生物学特性。结论:双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合,实现了厌氧菌和酵母的跨界融合,为双歧杆菌生物学功能的开发提供新思路、新途径。     

双歧杆菌原生质体的制备及其转化系统的建立

考察了长双歧杆菌WBL001菌体生长状态、酶解浓度、时长、温度以及不同渗透压稳定剂等因素,获得长双歧杆菌WBL001原生质体制备及再生的优化条件:长双歧杆菌以3%接种量活化至MRS培养基,培养至对数中期(OD600∶1),5μg/mL变溶菌素,37℃孵育30 min,以原生质体稳定液SMM为反应缓冲液,原生质体生成率达到81%,其再生率达到48%;在此基础上,通过聚乙二醇PEG融合,将穿梭表达载体pBAX转入双歧杆菌原生质体,成功建立双歧杆菌转化体系。     

产胸苷磷酸化酶短乳杆菌融合菌株的构建及其特性

利用紫外加热灭活双亲原生质体技术对短乳杆菌原生质体进行融合,考察短乳杆菌原生质体制备、再生及融合的影响因素,并对短乳杆菌融合子产酶能力和遗传稳定性进行了研究。结果表明:短乳杆菌在含0.6%甘氨酸发酵培养液培养至对数生长期,2 mg/mL溶菌酶于37℃恒温水浴酶解脱壁2 h,原生质体制备率和再生率可达95%和48%;20 W紫外灯距离20 cm照射50 min,60℃处理短乳杆菌原生质体60 min,原生质体的灭活率几乎为100%;将双亲灭活的原生质体用40%PEG6000,30℃恒温融合10 min,筛选融合子F15并进行5次传代测试其胸苷磷酸化酶活均在1.500 U/mg湿菌体,较亲本酶活提高了50%。     

灭活原生质体融合技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量

以豆豉纤溶酶产生菌株蜡状芽孢杆菌UV-101和MW-101作为亲本菌株,首先对亲本原生质体进行紫外灭活,然后用PEG(6000)作为融合剂对灭活双亲进行原生质体融合.通过对再生平板上长出的融合子进行平板初筛和摇瓶复筛,最终获得一株高产菌株PF-101,其酶活比亲本菌株分别提高了74.47%和86.36%,并且该菌株具有良好的遗传稳定性.     

双亲灭活青霉菌与枯草芽孢杆菌原生质体融合

目的:为选育具有高纤维素酶活性且强抗逆性的新菌株,将高产纤维素酶的青霉菌Penicillium Q5与强抗逆性的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis K3进行原生质体融合。方法:采用双亲灭活原生质体技术对青霉菌与枯草芽孢杆菌进行原生质体融合,考察原生质体制备条件与融合中的影响因素。结果:对亲本菌株进行酶解前处理,随着酶解浓度和酶解时间的增加,原生质体的形成率随之增大,而再生率下降。对融合过程进行正交试验,结果在融合温度38℃,融合时间10 min,PEG质量浓度0.4 g/L的条件下,融合率为3.08×10-7。在172株融合子中筛选出1株R62,保留了亲本的酶活且在p H 8~10条件下有较强的抗逆性。结论:双灭活原生质体融合方法成功选育出具有抗逆性的高产纤维素酶菌株。     

α-ALDC产生菌的抗性标记与融合条件初探

利用青霉素和链霉素分别对α-ALDC产生菌枯草芽孢杆菌3226-5、V-20进行抗药性标记，筛选得到稳定的青霉素抗性标记株P-67和链霉素抗性标记株S-17，并以P-67和S-17为融合的亲本对其原生质体融合条件进行了初探。     

保加利亚乳酸杆菌与整肠生菌进行原生质体融合的研究

利用有芽孢的整肠生菌株（Bacillus licheniformis）与无芽孢的保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus）作为亲本．进行原生质体融合，并对融合子的产乳酸、丁二醇能力以及酸奶发酵能力进行了研究。结果表明，在MM培养基内，融合子乳酸产量为10．104mg／L、丁二醇产量为46．13mg／L，乳酸和丁二醇产量高于两亲本菌株。在CM培养基内，融合子乳酸产量为12．85mg／L其产量高于两亲本；丁二醇产量为69．19mg／L其产量高于保加利亚酸杆菌。在细胞形态上，融合子也与亲本存在一定的差异。在酸奶发酵的过程中，乳酸产量和pH值与亲本保加利亚乳酸杆菌发酵的结果一致。经过10次传代培养后，其遗传稳定性保持在99％以上。     

L-缬氨酸产生菌的原生质体融合及抗高糖融合株的筛选

通过原生质体融合技术选育出一株抗高糖的融合株。以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)NV128和黄色短杆菌(B.flavum)JV16(Leu-Ile-Met-)为亲本菌株,通过单灭活原生质体融合、高糖梯度平板筛选及进一步的硫酸二乙酯(DES)诱变,获得了一株L-缬氨酸高产菌NJ-237。同时研究了影响原生质体形成、再生的3种重要条件(青霉素、酶和渗透压稳定剂),并确定了其最佳处理浓度和时间。该融合株经7 L发酵罐培养72 h L-缬氨酸达到46.8 g/L,糖酸转化率为27.7%,比两亲株都有显著提高。     

酿酒酵母与粟酒裂殖酵母融合子检出方法的研究

为了快速检出酿酒酵母与粟酒裂殖酵母的融合子,在双亲原生质体融合处理后,利用两亲本再生营养条件的差异及氧化邻苯二胺能力的不同,通过设计选择性底层培养基和鉴定性上层培养基,进行了融合子检出方法的研究,并确定了3株融合子。该方法简单易行,可用于酿酒酵母与粟酒裂殖酵母原生质体融合育种的研究。     

一株高产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌的构建

以产3-羟基丁酮枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TH-49(Val-)和产α-乙酰乳酸脱羧酶地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)AD-30为亲本菌株,以聚乙二醇为融合促进剂,进行原生质体融合获得融合子,融合子经再生、筛选等过程,最终获得高产3-羟基丁酮菌株HB-32,该菌株3-羟基丁酮产量高达49.64 g/L,比菌株TH-49(Val-)提高了61.8%,且遗传稳定性良好。进一步采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,从分子水平上分析了高产3-羟基丁酮菌株HB-32与亲本菌株基因组的变化。结果表明,枯草芽孢杆菌(B. subtilis)TH-49(Val-)和地衣芽孢杆菌(B. licheniformis)AD-30原生质体融合成功,提高了融合子HB-32 3-羟基丁酮产量。     

α-ALDC产生菌的抗性标记与融合条件初探

利用青霉素和链霉素分别对α-ALDC产生菌枯草芽孢杆菌3226—5、V-20进行抗药性标记，筛选得到稳定的青霉素抗性标记株P-67和链霉素抗性标记株S-17，并以P-67和S-17为融合的亲本在溶菌酶浓度、酶解时间、酶解温度、PEG浓度和pH值等不同的条件下进行原生质体融合，从而确定了其融合的最佳条件。     

酿酒酵母与粟酒裂殖酵母融合子检出方法的研究

为了快速检出酿酒酵母与粟酒裂殖酵母的融合子,在双亲原生质体融合处理后,利用两亲本再生营养条件的差异及氧化邻苯二胺能力的不同,通过设计选择性底层培养基和鉴定性上层培养基,进行了融合子检出方法的研究,并确定了3株融合子.该方法简单易行,可用于酿酒酵母与粟酒裂殖酵母原生质体融合育种的研究.     

利用原生质体融合技术构建梨酒酵母工程菌

以菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YDJ05及产香酵母Issatchenkia orientalis YS03为融合亲本X和Y,通过原生质体融合技术构建适合梨酒酿造的酵母工程菌,研究结果表明:利用EMS诱变亲本菌株Y,得到了一株精氨酸营养缺陷型菌株,亲本菌株X和Y采用蜗牛酶液在35℃下处理100min,得到菌株X、Y的原生质体融合率分别为93.6％、94.2％,再生率分别为27.8％、31.6％.以加热的方式灭活亲本菌株X,灭活时间为14min.在以PEG为促融剂的条件下对两株菌进行原生质体融合,经过优选得到融合子D J02,其产酒精率、产香率等指标最优,分别达到了9.87％、0.37g/L.     

利用生化方法鉴定灵芝原生质体融合子的研究

以美大灵芝和信州灵芝为出发菌株,采用化学融合法将两种灵芝原生质体进行融合,利用生化方法进行检测。结果表明:融合子胞外多糖含量与美大和信芝两亲本相比分别增加了332.80%和22.86%,胞内三萜含量与美大和信芝相比分别增加了36.21%和113.16%,胞外三萜含量与美大和信芝相比分别增加了23.17%和46.31%;采用琼脂糖凝胶电泳实验对融合子及亲本DNA进行检测,融合子DNA移动速度比亲本慢,说明融合子分子量大于两亲本,两亲本遗传物质发生重组。     

产细菌素乳酸菌原生质体融合

原生质体融合是一种直接有效的生物技术手段,可以快速改变微生物性状。作为一种20世纪70年代发展起来的基因重组技术,它有着其它技术无可比拟的优势,可以克服种间的不育性,使融合子同时具有双亲的优良性状。植物乳杆菌ZJ316具有良好的抑菌性,本试验中通过原生质体融合技术进一步提高其抑菌活性。群体感应系统(QS系统)在细菌素调控合成过程中起着重要的作用。本实验室对植物乳杆菌ZJ316全基因组进行测序,发现其QS系统中缺少两个重要的调控基因:plnC和plnD。然而,通过PCR验证,发现另一株具有良好抑菌活性的植物乳杆菌ZJQ基因组中含有plnC和plnD基因,说明成功获得植物乳杆菌ZJ316与植物乳杆菌ZJQ原生质体融合子,增加了细菌素产量,提高了抑菌活性。     

原生质体融合法构建增香型苹果酒酿造酵母的研究

以具有强发酵能力的酿酒酵母1605和产香能力好的苹果酒酵母E2为亲本,通过对原生质体融合条件的研究,得出以下结论:根据两亲本的生长曲线图确定两亲本在制备原生质体时的前培养时间为4h;在酶解温度35℃、蜗牛酶终质量分数为1%的条件下,最佳酶解时间为80min,此时,亲本菌株1605的原生质体形成率和再生率分别为92.4%和29.5%,亲本菌株E2的原生质体形成率和再生率分别为93.5%和30.7%;在60℃时,对亲本菌株1605的原生质体水浴灭活15min,即可完全抑制或钝化其原生质体活性。通过对融合子酿造苹果酒的感官和主要香气成分的分析,利用模糊综合评判法优选出8#菌株,该菌株具有产香能力好、发酵能力强的双亲优点,为优良的增香型苹果酒酵母菌株。     

细菌原生质体融合育种技术及其应用进展

原生质体融合技术是细菌遗传育种的有效方法之一,发展迅速,应用广泛。文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了细菌原生质体融合技术在遗传育种中的应用,并展望了细菌原生质体融合技术的发展前景。     

α-ALDC产生菌的抗性标记与融合条件初探

利用青霉素和链霉素分别对α-ALDC产生菌枯草芽孢杆菌3226-5、V-20进行抗药性标记,筛选得到稳定的青霉素抗性标记株P-67和链霉素抗性标记株S-17,并以P-67和S-17为融合的亲本在溶菌酶浓度,酶解时间,酶解温度,PEG浓度和pH等不同的条件下进行原生质体融合,从而确定了其融合的最佳条件。     

酵母属间融合子的构建及几种性状分析

以粟酒裂殖酵母和酿酒酵母为出发菌株,进行了原生质体融合试验,同时从个体形态、培养特征、自凝性及某些生化特性等方面对融合子的性状进行了研究,研究发现融合子在某些方面只表现单亲性状,有些方面兼有双亲性状,有些方面却与两亲本酵母的性状明显不同.这些研究为融合子的检出及鉴定工作提供了有益的参考.