地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化方法

通过体外处理诱导地衣芽孢杆菌产生感受态性能 ,同时调整参数 ,建立了感受态细胞对质粒 pAPR的高效电转化方法 .当质粒DNA为 1.5 μg/mL、转化时电压为175 0V时 ,可得到 2 6 1个转化子 ,经鉴定均为阳性克隆子 .此为以芽孢杆菌为宿主进行高效电转化及为建立适合工业应用的分泌型表达载体提供参考 .     

乳酸乳球菌高效电转化的方法

以质粒pMG36e和pNZ8148为材料,对乳酸乳球ATCC19435的电转化条件进行了优化研究.实验结果表明,乳酸乳球菌的最佳电转化条件为对数生长中后期的细胞,电场强度12 kV/cm,质粒浓度0.1～1 mg/L,复苏时间2 h,此时质粒pMG36e和pNZ8148时供试菌株的电转化效率分别为1.95x105μg-1和2.18x105μg-1,比优化前电转化效率均提高10倍以上.本研究为外源基因电转化乳酸乳球菌提供了可靠的试验参数依据.     

感受态细胞制备技术的研究进展

本文主要介绍感受态细胞的概念以及简要叙述该技术的发展史,目前人们掌握获取感受态细胞的有很多方法,本文将列举几种制备感受态细胞的方法,并说明各种方法的特点。感受态细胞制备完成后要经过转化才可进行后续的试验,所以文中对于感受态细胞转化的影响因素进行了阐述。最后,列举近年来研究人员在这一领域取得的进展并展望未来这一领域。     

不同感受态细胞制备方法对副干酪乳杆菌转化效率的影响

目的:研究不同感受态细胞制备方法对副干酪乳杆菌转化效率的影响。方法:优化并比较未处理、青霉素处理法、溶菌酶处理法及NaCl处理法制备的感受态细胞的转化效果。结果:优化各处理法获得的条件分别为:未处理法OD600为0.8,甘氨酸质量浓度为3 g/mL,青霉素终质量浓度为12.5μg/mL,溶菌酶质量浓度为10 mg/mL,NaCl浓度为0.7 mol/L。不同处理方法获得的感受态细胞转化效率差异显著(P0.05),转化效率由高到低依次为青霉素处理法【(1.64±0.05)×103cfu/μg质粒】、甘氨酸处理法【(1.51±0.03)×103 cfu/μg质粒】、NaCl处理法【(1.20±0.04)×103cfu/μg质粒】、溶酶菌处理法【(0.56±0.02)×103 cfu/μg质粒】、未处理法【(0.43±0.01)×103 cfu/μg质粒】。结论:青霉素、甘氨酸及NaCl处理法制备的感受态细胞能够有效提高副干酪乳杆菌转化效率,为副干酪乳杆菌遗传转化体系的建立奠定基础。     

利用响应面法优化发酵乳杆菌AR497电转化条件

以1株能有效改善小鼠肠炎的发酵乳杆菌AR497为研究对象,在Plackett-Burman试验的基础上选取甘氨酸质量浓度、OD_(600)、电场强度和山梨醇浓度为自变量,电转化效率为响应值,利用Box-Behnken响应面法优化其电转化条件。最优条件为:电场强度15 kV/cm,山梨醇浓度0.6 mol/L,OD_(600)0.2,甘氨酸质量浓度26 g/L。在此条件下,电转化效率高达2.78×10~5 CFU/μg DNA,比优化前提高了22倍,实现了发酵乳杆菌AR497的高效遗传转化,为后续对其进行遗传改造和解析抗炎机制奠定基础。     

基于原生质体法保加利亚乳杆菌电转化条件的研究

目的:研究不同因素对保加利亚乳杆菌原生质体法电转化效率的影响,通过研究电转化的最适条件,以提高电转化的效率。方法:以保加利亚乳杆菌为受体菌株,大肠杆菌-乳酸菌穿梭型质粒pMG36e为载体,通过原生质体电转化的方法研究溶菌酶浓度、质粒浓度、电转化参数、复苏培养基组成对电转化效率的影响。结果:用SMM在37℃下制备溶菌酶(30 mg/mL)对细胞进行酶解,直至通过显微镜发现约60%的原生质体形成。用1μL质量浓度为1.2μg/μL的质粒pMG36e,在电场强度7.5 kV/cm,电阻200Ω,电容25μF的条件进行电击转化,以含有0.5 mol/L蔗糖和20 mmol/L的MgCl_2、CaCl_2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2.5 h,并以含红霉素的MRS平板筛选,获得1.42×10~5CFU/μgDNA的电转化效率。结论:本研究实现了保加利亚乳杆菌的高效遗传转化,并为遗传育种提供了技术支持。     

过量表达苹果酸酶对E.coli脂肪酸合成能力的影响

为了考察苹果酸酶对原核生物脂肪酸合成能力的影响,本研究从E.coliK-12中克隆了苹果酸酶基因（NADPME,EC1.1.1.40）MaeB,并插入质粒pET30a-T,构建了重组质粒pMX20,经IPTG诱导在E.coli BL2（IDE3）获得了大量表达。摇瓶发酵结果表明,过量表达苹果酸酶基因会改变大肠杆菌脂肪酸合成能力,并在添加适宜底物苹果酸（15mmol/L）时,胞内总酯含量比受体菌提高了4倍,约197.74mg/g,产率为1.89%。本研究为脂肪酸生产提供了优良菌株,具有一定的应用开发前景。      

重组菌细胞转化法制备茶氨酸的研究

利用重组菌细胞中的γ-谷氨酰转肽酶转化制备L-茶氨酸。分析了温度、pH、底物浓度、菌体浓度、反应时间等因素对茶氨酸产量的影响。试验结果表明,最佳工艺为:温度37℃,pH10.0,菌体浓度20 g/L,底物浓度0.25 mol/L,反应时间5 h,产量达11.26 g/L。细胞可连续使用3次,产量稳定。     

乳酸菌细胞转化法制备γ-氨基丁酸的研究

在利用乳酸菌Lactococcus lactis1.009细胞中的谷氨酸脱羧酶转化制备γ-氨基丁酸（GABA）的过程中,探讨了菌体浓度、缓冲液种类及浓度、转化时间、菌龄、磷酸吡哆醛添加量、底物添加方式等因素对GABA产量的影响。结果表明,细胞转化法制备GABA的最佳条件为:菌体浓度10g/L,菌龄14h,缓冲液为0.2mol/L pH4.7的醋酸缓冲液,PLP的添加量为0.1mmol/L。通过多次分批添加谷氨酸,50℃下反应60h后,GABA的积累量可达19.1g/L,转化率为99.9%。      

乳酸菌细胞转化法制备γ-氨基丁酸的研究

在利用乳酸茵Lactococcus lactis 1.009细胞中的谷氨酸脱羧酶转化制备γ-氨基丁酸(GABA)的过程中,探讨了茵体浓度、缓冲液种类及浓度、转化时间、茵龄、磷酸吡哆醛添加量、底物添加方式等因素对GABA产量的影响.结果表明,细胞转化法制备GABA的最佳条件为:菌体浓度10g/L,茵龄14h,缓冲液为0.2mol/L pH4.7的醋酸缓冲液,PLP的添加量为0.Immol/L.通过多次分批添加谷氨酸,50℃下反应60h后,GABA的积累量可迭19.1g/L,转化率为99.9%.     

核心多糖结构变异对大肠杆菌自凝集特性的影响

以大肠杆菌K-12菌株为研究对象,通过对比分析野生型W3110及脂多糖分子核心多糖结构变异菌株的自凝集特性,对细胞膜上核心多糖结构与细菌自凝集的相关性进行分析。结果表明,核心多糖的结构变异会增加大肠杆菌的自凝集能力,在4℃下静置12 h,突变菌株自凝集率较野生型菌株提高近3倍。以核心多糖缺失突变菌株ΔwaaC和外核心糖缺失突变菌株ΔwaaG为研究对象,进行菌株自凝集动力曲线测定。结果表明,在静置2 h后,菌株自凝集率均可达80%以上。通过对不同温度和不同菌液浓度下菌株自凝集特性的分析,温度与菌株的自凝集特性无明显相关性,而较高的菌液浓度能够提高菌株的自凝集能力。为分析突变菌株自凝集形成机制,以野生型W3110为对照,对突变菌株自转运蛋白编码基因flu进行RT-PCR分析,突变菌株中flu基因的转录水平增加2~4倍。同时,利用表达质粒pWSK29构建自转运蛋白质表达载体,通过诱导表达,确定自转运蛋白质在大肠杆菌W3110自凝集中的作用。     

重组干扰素-tau在大肠杆菌中的高效表达

目的研究重组干扰素-tau的纯化和复性。方法将构建好的重组质粒pBV220转化E.coli BL21,发酵培养后迅速升温至42℃诱导干扰素-tau以包涵体的形式高效表达。裂菌后利用8mol/L尿素溶解目的蛋白质,经凝胶过滤色谱层析纯化后,再透析复性。结果干扰素-tau的表达量占菌体总蛋白质量的20%以上,纯化后纯度可达9 6%以上,活性得到有效恢复。结论建立了干扰素-tau纯化及复性的方法,获得了高表达、高纯度、有活性的干扰素-tau。     

大肠杆菌色氨酸酶的制备及酶学性质

以硫酸铵沉淀法分离提取大肠杆菌色氨酸酶,进行色氨酸酶学性质检测及动力学初步探讨。结果表明：使用50℃水浴法进行细胞壁的破碎,提取粗TPase 酶液效果较好;(NH₄)₂SO₄ 粗提色氨酸酶有较好效果;色氨酸酶的最佳反应pH 值为8.0,在pH5.5～7.5 较稳定;最高耐受温度65℃,最佳反应温度45℃;K⁺、NH⁴⁺ 能够明显地提高色氨酸酶活性,而Na+ 则明显地抑制酶活性。对色氨酸酶的动力学研究表明,在相同反应条件下,针对底物L- 丝氨酸的米式常数Km 值远远大于吲哚的Km 值。     

食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的研制

目的建立食品检测用大肠埃希氏菌标准物质的制备方法, 研制均匀稳定的标准物质,用于实验室内部质量控制。方法采用冷冻干燥技术制备含量为4-5×104CFU/样品的菌球,参照《CNAS-GL29：2010标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,随机抽取20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析;将样品分别于-20℃、4℃、25℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。并组织3家实验室进行协同标定,再使用20件食品作为基质,按照国标法检验大肠埃希氏菌标准物质的适用性。结果对20瓶标准物质的均匀性检测结果进行单因子方差分析： F=1.933, 符合标准物质的要求。标准物质在?20 ℃保藏28 d,复苏率为96.2%;在4 ℃保藏14 d,复苏率为77.0%;25 ℃保藏7 d,样品中菌含量仍保持在104CFU/样品的水平,说明样品的短期储藏稳定性、长期储藏稳定性和运输稳定性都符合要求。经3家实验室协同标定, 样品活菌含量均在104CFU/样品水平,生化鉴定结果均符合大肠埃希氏菌的特征;标准物质加入到20种食品基质中, 均可以检出大肠埃希氏菌,活菌含量仍保持在104CFU/样品的水平。结论本研究所制备的大肠埃希氏菌标准物质的均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求,适用性良好,可用于食品检测实验室的质量控制和食品中大肠埃希氏菌检测结果的评价。     

酵母细胞的高效转化方法

运用醋酸锂处理酵母细胞，建立并优化了酵母完整细胞的高效质粒转化体系，转化率达１０４μｇ－１．通过对影响转化的诸因子的研究，发现载运ＤＮＡ是影响酵母完整细胞转化效率的最主要因素，热休克处理及处理时间、聚乙二醇相对分子质量及浓度等对转化率也有显著影响。     

特异性抗肠出血性大肠杆菌O157:H7内毒素鸡卵黄抗体的制备

目的:比较研究LPS和O-SP的免疫原性,制备出特异性抗内毒素(LPS)鸡卵黄免疫球蛋白(eggyolkimmunoglobulin,IgY),用于对E.coliO157:H7的免疫预防及检测。方法:分别用灭活E.coliO157:H7菌体、不同浓度内毒素(LPS)及O-特异性多糖链(O-SP)与不完全弗氏佐剂充分乳化后作抗原免疫临产蛋母鸡,以水稀释法从卵黄中提取抗体,阴离子交换色谱法实现对抗体的纯化,间接ELISA及双向免疫扩散检测抗体产生效价与活性。结果与结论:所制内毒素(LPS)和O-SP均有较好的免疫原性,刺激鸡体后可产生高效价抗体,灭活菌体、600μg/mlLPS、1200μg/mlLPS、2000μg/mlLPS、O-SP抗体产生效价最高可分别达1:32000、1:28000、1:32000、1:12000、1:40000。结合离子交换色谱,用0.185mol/L的离子强度可实现一步洗脱纯化抗体,制备出高纯度、高活性、特异性强的鸡卵黄免疫球蛋白IgY,为大肠杆菌O157:H7的感染防治提供了可靠的保证,在此实验基础之上可进一步探讨应用特异性IgY对大肠杆菌O157:H7的检测。     

酱油等调味品中大肠杆菌存活与分析

分析大肠杆菌在酱油中的存活特性,为酱油等调味品的卫生控制和检测提供技术指导。将购置的标准大肠杆菌菌株和从酱料中分离的野生型大肠杆菌人工接到大肠杆菌阴性的不同品种和厂家的瓶装酱油中,采用国家标准方法定期检测大肠杆菌的个数,计算大肠杆菌的存活时间,对大肠杆菌在不同品种和不同厂家酱油中的时间的存活率进行了研究。结果表明,不同种类大肠杆菌在酱油中存活时间不同,同种大肠杆菌在老抽系列酱油中的存活时间长于在生抽酱油的存活时间,时间长2 d~4 d,而在生抽中存活时间为1 d,存活时间短于以前的报道。同时普查了大肠杆菌在国内其他厂家酱油中的存活时间,发现存活时间多为1 d~2 d,并且不同种类存活时间存在差异。大肠杆菌在酱油中致死现象和机制有待进一步分析,该研究为当前控制酱油中大肠杆菌的污染问题提出了新的证据和启示。     

大肠杆菌对酸的抗性变化研究

由于大肠杆菌具有耐酸性,且乳酸可引起大肠杆菌的亚致死性损伤,故使其成为食品安全领域关注的重要问题之一.了解不同酸性条件下大肠杆菌的生存特点,有助于人们进一步认识其耐酸性的分子机制,从而为制定预防方案和措施提供理论依据.     

食品检测用肠道侵袭性大肠埃希氏菌标准物质的研制

目的 为满足肠道侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive Escherichia coli, EIEC)准确检测的实验室质量控制和能力验证需求,研制具有我国自主知识产权、稳定性良好且具有清晰基因组信息背景的即用型EIEC标准物质。方法 利用二代高通量测序技术对EIEC(CMCC 44840)进行全基因组测序,明确CMCC 44840的种属、血清型、多位点序列分型(MLST)和毒力基因;采用冷冻干燥技术制备活菌含量为10³ CFU的EIEC冻干样品;参照CNAS-GL017-2018进行均匀性检验,并采用单因素方差分析对结果进行统计分析;将样品分别于-20 ℃、4 ℃、25 ℃和37 ℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输性进行评价;利用5种食品基质样本进行标准物质的使用效果验证,同时组织3家实验室进行协同标定。结果 CMCC 44840基因组大小为4.96 Mb,GC含量为50.7%,编码基因5 424个,种属鉴定结果为大肠埃希氏菌,(Escherichia coli)血清预测结果为O28ac:H7,MLST为ST311型,携带ipaH、virB、virF等毒力基因;制备的EIEC冻干样品均匀性检验结果F=1.79,符合标准物质均匀性要求;冻干样品在25 ℃和4 ℃下保藏7 d,-20 ℃和4 ℃下保藏60 d,菌含量均保持在10³CFU水平,在37 ℃下第3 d菌含量出现下降,低于10³CFU水平;添加EIEC冻干样品的20件不同食品基质样品经增菌后均检出EIEC;3家协同标定实验室测定EIEC冻干样品菌含量均为10³ CFU,且实验室间无显著性差异(F=0.59)。结论 本研究所制备的EIEC标准物质所用菌株具有清晰的基因组序列信息,均匀性和稳定性均符合要求,适用性良好,能够满足食品检测实验室的质量控制和能力验证的需求。     

菌液浓度对大肠杆菌超高压杀灭效果的影响

本实验采用响应曲面法的中心组合设计法,对大肠杆菌超高压杀灭效果进行了研究,着重探讨了菌液浓度对致死率的影响。依据实验结果,建立了大肠杆菌超高压致死的响应模型,y=81.26-8.3x1+29.3x2+5.5x3+7.7x4+11.2x1x2-1.4x1x3+3.4x1x4-5.4x2x3-4.8x2x4-1.4x3x4+0.5x12-1.9x22+1.1x32-6.7x42,方差分析表明,模型拟合度高,实验误差小,可应用于压力对大肠杆菌致死效应的分析和预测。样品的菌液浓度是超高压杀菌效果的显著影响因素,并与压力因素之间存在显著的交互作用。大肠杆菌的致死率随着菌液浓度的增加而下降,随着压力的增加而迅速上升,低含菌量时,较低的压力就可达到杀菌要求,而高含菌量则需较高的压力。此外,压力、温度、时间均是超高压杀菌效果的显著影响因素。根据加工对象含菌量的不同,应选择合适的工艺参数,使超高压杀菌操作更有效和具有实际意义。