生物法生产丙烯酰胺过程中腈水合酶的抑制和失活

为改进生物法生产丙烯酰胺工艺,研究了腈水合酶催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺过程中影响腈水合酶反应速率和酶失活的因素. 实验证明,水合过程中体系pH值的变化基本不影响酶反应速率;底物丙烯腈的浓度低于10 g/L时,酶反应速率与底物浓度成正比,大于75 g/L后,对酶有抑制作用;产物丙烯酰胺显著抑制腈水合酶的活性;菌体细胞内可能存在可以稳定腈水合酶的物质,胞内的腈水合酶在40℃下的半衰期可以达到59.9 h;丙烯酰胺与温度的协同作用是腈水合酶失活的重要原因.     

产腈水合酶菌株的驯化研究

以Nocardia sp. LNSY0611为出发菌株,通过逐渐增加培养基中丙烯腈的浓度重复继代培养,得到一株酶活为72.5 U·mg-1的腈水合酶高活力菌株Nocardia sp. LNSY0611XH,酶活比出发菌株提高了15倍.初步确定驯化最优条件为:葡萄糖20 g·L-1、诱导剂脲0.06 g·L-1、Co2 0.3 g·L-1、丙烯酰胺10%、温度30℃及pH 7.在此条件下,腈水合酶可高效表达.     

极端条件驯化法提高腈水合酶产生菌的丙烯酰胺耐受性

为了提高产腈水合酶的菌体Nocardia sp.对催化产物丙烯酰胺的耐受性,利用极端条件改造了现有的丙烯酰胺生产菌株RS,通过向发酵液间歇加入丙烯腈催化生成丙烯酰胺,为菌体制造出一个极端环境,使菌体在生长催化过程中逐渐适应高浓度丙烯酰胺,强化其丙烯酰胺耐受性,驯化得到了RS-1菌株. 研究了驯化过程中菌体存活率、比死亡速率和腈水合酶活性随丙烯酰胺浓度的变化. 在不同的丙烯酰胺初始浓度(0~400 g/L)下比较了两菌株的丙烯酰胺耐受性,RS-1菌体催化丙烯腈水合的速率都大于RS菌体,平均提高30.8%;而且RS-1菌株的胞内腈水合酶也具有较好的丙烯酰胺耐受性. 在相同的水合条件下,RS-1菌株催化所得的丙烯酰胺终浓度和丙烯腈转化率分别为587.1 g/L和99.97%,都明显优于RS菌株的水合结果. 在进一步的水合实验中,RS-1菌株催化所得的丙烯酰胺终浓度达到了641.4 g/L.     

腈水合酶固定化方法和催化特性的研究

以一种能够产生腈水合酶诺卡氏菌为研究对象,针对原来的海藻酸盐包埋法存在的固定化细胞强度较小、通透性较差等问题,改进了对酶的固定化方法,并对固定化腈水合酶的催化特性:最适反应温度、pH值、底物丙烯腈浓度、和表面活性剂性质和丙烯酰胺累积浓度对酶活性的影响等五个方面进行了研究。其中固定化腈水合酶最适反应温度在15~25°C;pH 7.0左右;底物丙烯腈浓度为3%~4%;Triton X-100对酶活性基本无影响,而Tween 80和Tween 60对酶活力有抑制作用;固定化腈水合酶在丙烯酰胺累积浓度为15%~20%之间时,酶活性较好。     

耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学

双亚基腈水合酶是催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺的重要工业酶。通过Discovery Studio 2.5软件对C-末端盐桥耦合定点突变改造的耐热型基因重组腈水合酶NHaseM-TH-SBM(S344K-S346K-L347E-N362S-435DT436(+))进行盐桥网络分析,发现其全局盐桥总数有所下降,但双亚基界面间盐桥数量提高到7个。在重组大肠杆菌中表达了原腈水合酶NHaseM-TH(TH)、盐桥突变酶NHaseM-TH-SB(SB)和盐桥耦合定点突变的重组酶NHaseM-TH-SBM(SBM),研究了3种酶的催化反应动力学和失活动力学。结果表明,SBM的腈水合酶活性为543.9 U·mg?1,比TH提高了31.0%;其米氏方程催化速率常数Kcat比TH提高了20%。SBM的表观失活常数KD在25~42℃范围内均明显低于对照TH,在42℃时为TH的68.0%,显示了良好的热稳定性。SBM是活性和稳定性同时提高的重组腈水合酶。     

耦合末端盐桥与定点突变的重组腈水合酶催化动力学

双亚基腈水合酶是催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺的重要工业酶。通过Discovery Studio 2.5软件对C-末端盐桥耦合定点突变改造的耐热型基因重组腈水合酶NHase^M-TH-SB^M（S344K-S346K-L347E-N362S-435DT436（+））进行盐桥网络分析,发现其全局盐桥总数有所下降,但双亚基界面间盐桥数量提高到7个。在重组大肠杆菌中表达了原腈水合酶NHase^M-TH（TH）、盐桥突变酶NHase^M-TH-SB（SB）和盐桥耦合定点突变的重组酶NHase^M-TH-SB^M（SB^M）,研究了3种酶的催化反应动力学和失活动力学。结果表明,SB^M的腈水合酶活性为543.9 U·mg^-1,比TH提高了31.0%;其米氏方程催化速率常数K_cat比TH提高了20%。SB^M的表观失活常数K_D在25～42℃范围内均明显低于对照TH,在42℃时为TH的68.0%,显示了良好的热稳定性。SB^M是活性和稳定性同时提高的重组腈水合酶。     

反应分离耦合酶法制备D-苹果酸

用Pimelobacter simplex DM18菌的马来酸水合酶高效转化马来酸制备D-苹果酸。为避免高浓度产物及底物对水合酶的抑制作用,利用马来酸和D-苹果酸的钙盐溶解度低的特点,以马来酸钙为底物,经水合酶催化加水转化成D-苹果酸钙,实现边反应边分离产物的反应分离耦合,同时利用钙盐和钠盐的混合反应体系提高了转化反应速率,反应36 h,可制备386g/L的D-苹果酸钙盐,相当于300 g／L D-苹果酸,转化率接近99％,光学纯度达97.03％。     

腈水合酶的发酵研究

Nocardh sp163#在含有脲和钴的培养基中发酵生产腈水合酶,可以催化丙烯腈水合为丙烯酰胺。调节培养条件使发酵液的酶活力达到815万u／ml。温度28—30℃,反应体系呈中性酶活性很高并且稳定。     

腈水合酶/酰胺酶体系制备蛋氨酸羟基类似物

西洼湖戈登氏菌CGMCC 4.218 4含有一个高效的腈水合酶/酰胺酶体系。本文利用该菌株全细胞中的腈水合酶(Nitrile hydratas)催化2-羟基-4-甲硫基丁腈(HMTBN)水合为2-羟基-4-甲硫基丁酰胺(HMTBAm),利用酰胺酶(Amidase)以原位串联的方式将2-羟基-4-甲硫基丁酰胺水解为2-羟基-4-甲硫基丁酸(HMTBA,蛋氨酸羟基类似物)。考察了底物浓度、细胞质量浓度、温度、pH、反应时间对腈水合酶和酰胺酶活性的影响,对腈水合酶、酰胺酶的热稳定性和pH稳定性进行了测定。结果表明,最优的反应条件为:50 mmol/L HMTBN,3 g/L干重细胞,温度30℃,pH=8.0,反应时间30 min。在最优反应条件下,采用分批补料策略,细胞可使用23批次,HMTBA的累积量在44 h内达到164 g/L,其产率为95%。     

Al~(3+)/UV催化臭氧去除偶氮二异丁腈废水中CN~-的研究

研究Al3+/UV催化臭氧对偶氮二异丁腈废水中CN-的降解特性。分析了pH、Al3+投加量和O3浓度对Al3+/UV催化臭氧降解CN-的影响。探讨Al3+/UV催化臭氧工艺中光催化反应动力学特征。结果表明,当pH值为9.0、Al3+投加量为0.61 g·L-1和气相臭氧质量浓度为50~55 mg·L-1时,偶氮二异丁腈废水中CN-的降解效果较好。Al3+/UV催化臭氧工艺降解腈纶废水的反应符合类一级动力学反应,偶氮二异丁腈废水中的初始CN-值在600~1500 mg·L-1时,一级反应速率常数为0.03011~0.00651 min-1。所需水力停留时间为240 mim。     

游离静止细胞中腈水合酶的失活动力学

Nitrile hydratase (NHase) is an important industrial enzyme used for acrylamide production from acrylonitrile. The deactivation kinetics of NHases in free resting cells of Rhodococcus sp. was presented based on a bi-steady state assumption. Effects of hydration temperature, product concentration and substrate concentration on NHase deactivation were investigated experimentally and correlated with a first order deactivation kinetics. The results showed that the hydration temperature and product concentration were major factors governing the deactivation of NHases under substrate-feeding conditions. When acrylamide concentration was higher than 250 g•L－1, the deactivation of NHases became serious and the bi-steady state assumption was not applicable. When the hydration temperature was controlled at a relatively higher level such as 28°C, the total deactivation rate constant was about 2.8-fold of that at 20°C.     

Nocardia sp.高丙烯酰胺耐受性菌株及水合结晶工艺

在极端条件下改造了现有的丙烯酰胺生产菌株Nocardia sp.RS,通过向发酵液中间歇加入丙烯腈催化生成丙烯酰胺而形成极端环境,将菌体生长、酶催化和菌种筛选这3个过程耦合在一起.研究了极端条件下菌体存活率、腈水合酶活性随丙烯酰胺浓度的变化.驯化得到的RS-1菌株有很好的丙烯酰胺耐受性,摇瓶水合的丙烯酰胺终浓度达到了587 g•L^-1,比RS菌株提高30.6％.利用RS-1菌株在小型反应器规模上实现了高浓度丙烯酰胺的制备,累积浓度达到了535 g•L^-1,不需浓缩即可满足市场对丙烯酰胺水溶液产品的浓度要求.在此基础上,设计了水合结晶改进工艺,预计可比现有工艺降低浓缩能耗32.8％.     

聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)水凝胶对铜离子的体积响应动力学

采用微波辐射法制备了N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸共聚水凝胶,探讨了该水凝胶对Cu²⁺的响应动力学,并估算出此过程中水凝胶的体积收缩速率常数及其反应活化能,同时建立了Cu²⁺浓度对水凝胶体积收缩响应速率常数影响的数学关系模型。实验结果表明,水凝胶对Cu²⁺所产生的体积收缩响应符合拟一级动力学反应。在40～60℃水溶液中,水凝胶的收缩速率随溶液中Cu²⁺浓度的增高而加快,其反应活化能在36～42 kJ•mol^-1之间,且随着溶液中Cu²⁺浓度的增大而逐渐减小。重复性实验表明,该共聚水凝胶经过3次体积收缩(50.0℃溶液)/溶胀(6.0℃溶液)的循环实验,它在含Cu²⁺水溶液中对温度变化仍能保持高灵敏度的体积收缩/溶胀响应,而且其3次体积收缩/溶胀响应值几乎一样,有很好的重现性。     

有机相酶法不对称水解乳酸乙酯

探讨了在有机介质中酶催化外消旋乳酸乙酯不对称水解制备L-乳酸的可行性。 研究了反应介质、不同来源的酶、摇床转速、水含量、乳酸乙酯浓度及温度等因素对反应的影响。结果表明,N435的活性和选择性较高,叔丁醇和异辛烷的混合溶剂（体积比为1∶1）为最合适的反应介质,其余最适条件为：摇床转数200 r•min^-1、水含量（水与底物的质量比）1∶5、乳酸乙酯浓度0.27 g•ml^-1、酶浓0.8 g•mol^-1、反应温度60℃,在此条件下反应16 h得产物ee值为90.02% ,产率为28.69%。 最后研究了乳酸乙酯不对称水解的动力学,结果表明反应符合米氏方程,属于双底物抑制的双乒乓机制,并考察了D-乳酸乙酯和D-乳酸在建立反应动力学模型时的影响。     

有机相中酶催化1-苯基乙胺的不对称酰胺化反应

在有机相中,对酶催化条件下的1-苯基乙胺酰胺化反应进行了研究。通过对酰基供体、酶、溶剂的筛选和酯量、底物胺浓度、酶量、摇床转速、反应温度等影响因素的考察,发现乙酸异丙烯酯为较佳的酰基供体,脂肪酶Novozym 435对该反应的催化活性和对映体选择性较高,甲苯为最适的介质,最适酯量为底物胺量的0.6倍,最佳底物胺浓度、酶量、摇床转速、温度分别为200 mmol·L^-1、4 mg·ml^-1、200 r·min^-1、30℃。在此优化条件下反应的对映体选择率（E）达到89。反应4 h转化率为39％,产物的对映体过剩值（ee_p）为96％;反应10 h转化率达到52.4％,底物的对映体过剩值（ee_s）为98％。     

5-羟甲基糠醛在稀硫酸催化下的降解反应动力学

5-羟甲基糠醛脱羧生成乙酰丙酸是生物质资源出发制备乙酰丙酸过程中的关键步骤之一。为了研究低硫酸浓度下水解生物质制备乙酰丙酸工艺的可行性,系统地测定了在压力5 MPa、初始浓度1～9 mg·ml^-1、硫酸浓度0.05%～0.4%（质量分数）、温度150～190℃条件下,5-羟甲基糠醛在稀硫酸催化下的降解反应动力学数据,并以主反应生成乙酰丙酸、副反应生成腐黑质的平行反应动力学模型对数据进行了拟合,拟合结果表明,在实验范围内,主、副反应对5-羟甲基糠醛均为一级反应;主反应对H⁺浓度为1.16级,反应的活化能为78.5 kJ·mol^-1;副反应对H⁺浓度为0.722级,反应的活化能为98.0 kJ·mol^-1。研究结果表明,降低温度和提高硫酸浓度有利于提高生成乙酰丙酸的选择性。     

基于动力学模型的丙酮酸分批发酵温度控制策略

在对不同温度下Torulopsis glabrata分批发酵生产丙酮酸过程进行详尽分析的基础上,建立丙酮酸分批发酵动力学模型,并分析了温度与动力学参数之间的函数关系,提出T.glabrata高产量、高产率和高强度发酵生产丙酮酸的温度控制轨迹：在发酵初始阶段(0～8 h) 控制发酵温度为34℃以维持较高的菌体生长速率和丙酮酸合成速率;发酵中期(8～42 h),逐步将发酵温度降到27℃以获取代谢流强化和细胞衰亡之间的最佳平衡;然后维持27℃至发酵结束以提高细胞后续产酸能力。采用这一最佳温度控制轨迹,丙酮酸产量(89.4 g •L^-1)、对葡萄糖产率(0.76 g •g^-1)和生产强度(1.32 g •L^-1 •h^-1)比30℃恒温发酵分别提高了25.7%、16.9%和48.3%。     

TiO2纳米管/UV/O3对腐殖酸的降解动力学

用自制的TiO₂纳米管（TNTs）作为催化剂,对腐殖酸进行TNTs/UV/O₃工艺降解研究.从动力学角度分析了光催化、臭氧化的协同作用及催化剂煅烧温度的影响,考察了反应温度、初始pH值、催化剂投加量和臭氧投加量对降解速率的影响,建立了新型动力学模型.结果表明,光催化和臭氧化有很强的协同作用,催化剂最佳煅烧温度为400℃,腐殖酸的TOC降解过程符合零级反应,模型显示当原水pH值为7.35,TNTs投加量0.806g·L^-1,O₃投加量0.49g·h^-1时TNTs/UV/O₃对腐殖酸TOC的降解取得最佳反应速率,当反应温度T为25℃时,最佳k为0.8095mg·L^-1·min^-1,当反应温度T为30℃时,最佳k为0.8231mg·L^-1·min^-1.试验结果和模型结果对比得出试验值基本符合动力学模型.     

水/有机溶剂体系中产紫青霉全细胞催化合成单葡糖醛酸基甘草次酸

研究了产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3 全细胞β-D-葡萄糖醛酸苷酶在水/有机溶剂体系中催化水解甘草酸,合成单葡糖醛酸基甘草次酸（GAMG）的反应。确定了最适反应体系为水/叔丁醇（体积比为3∶7）,最适反应条件为：底物甘草酸用量1.5 g•L^-1、反应温度45℃、pH值5.0、全细胞酶量7 g•L^-1、摇床转速120 r•min^-1,在此条件下反应48 h,产物GAMG产率可达79.12%,全细胞酶具有较好的稳定性和可重复使用性,显示了良好的应用前景。