用免疫生物传感器快速检测金黄色葡萄球菌的初步研究

目的研究快速、经济、高灵敏的金黄色葡萄球菌新型检测技术。方法本研究应用F0F1-ATP酶旋转分子马达和免疫技术相结合,建立金黄色葡萄球菌的免疫生物传感器快速检测技术。首先pH变化敏感的荧光物质F1300标记到F0F1-ATP酶的载体色素体的内表面,然后在F0F1-ATP酶上连接β亚基抗体-生物素-链亲和素-生物素-金葡菌抗体复合体,得到可以捕获金黄色葡萄球菌的免疫生物传感器。传感器上负载菌量不同,引起的酶活性变化不同,酶活性变化又引起色素体内pH变化,最后通过F1300的荧光强度变化来检测菌量。结果该方法对金黄色葡萄球菌标准菌株(CMCC26003)的检测时间为4.5h,102～104CFU/孔呈现良好的梯度关系。结论该技术耗时短、操作简单、成本低、灵敏度高,符合食品安全检测技术发展要求。     

利用F_0F_1-ATPase分子马达技术检测志贺氏菌

利用载色体chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器,建立应用在食品检测中快速检测方法。首先从嗜热菌中提取载色体,合成生物素化宋内氏志贺氏菌IpaH探针,在载色体ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体-生物素-链霉亲和素-生物素-IpaH探针,将待测宋内氏志贺氏菌标准菌株和阴性对照分别与此生物传感器结合,比较其催化ATP合成10 min后的ATP产生量,进而对宋内氏志贺氏菌DNA进行检测。ATP合成的量可以通过luciferase-luciferin检测试剂所体现的荧光强度大小标定。结果表明,chroIpaH(连接在载色体chro上的IpaH探针)的浓度在0.031 mg/mL,宋内氏志贺氏菌DNA浓度在50 ng/mL为最适检测条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及PCR检测方法对照,具有良好的检测符合性。     

分子马达传感器对沙门氏菌快速检测方法的初步研究

利用F0F1-ATP合酶的旋转特性及对H+敏感的荧光物质F-DHPE作为指示剂来检测样本中有无目标物。通过生物素-亲和素系统将特异性invA核酸探针连接在F0F1-ATPase的ε亚基上构建生物传感器;将待测样品和阴性对照分别与生物传感器结合后,比较其催化ATP合成30min后的ATP产生量,依此对样品中的沙门氏菌DNA进行检测。结果表明,该方法对沙门氏菌DNA的检测时间为1h,检出限为10ng/mL。从食品样本分离得到的30株细菌,利用分子马达生物传感器的检测结果与PCR检测的结果一致。     

利用分子马达技术检测霍乱弧菌

利用载色体chromatophore上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器,建立了应用在食品检测中的快速检测方法。首先在ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体-生物素-链霉亲和素-生物素-ompW探针,将待测霍乱弧菌和阴性对照分别与此生物传感器结合,比较其催化ATP合成30 min后的ATP产生量,进而对霍乱弧菌的DNA进行检测。ATP合成的量可以通过环境H+的量进行测定,H+的量通过F-DHPE所体现的荧光强度大小标定。结果表明,Chro ompW的浓度在0.078 mg/mL,单核增生李斯特菌DNA浓度在40 ng/mL为最适检测条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及PCR检测方法对照,具有良好的检测符合性。     

水产品中氯霉素时间分辨荧光免疫层析定量检测方法

该研究旨在建立一种简单、快速、高灵敏的鱼、虾和蟹中氯霉素残留的荧光定量免疫层析检测方法,以满足水产品中氯霉素残留检测的需求。通过将氯霉素鼠单克隆抗体G375-5与羧基化铕微球进行偶联标记,氯霉素抗原和羊抗鼠二抗分别包被于硝酸纤维素膜(NC)上作为检测线(T)和控制线(C);根据T线信号值与C线信号值的比值(T/C)和样本中氯霉素浓度建立定量标准曲线;针对鱼、虾、蟹样品,对荧光免疫层析检测方法的灵敏度、准确度和精密度等进行评价,并将其在实际水产样品中与HPLC法进行结果对比。结果表明,该研究建立的时间分辨荧光免疫层析检测方法对水产品中氯霉素的定量限为0.1μg/kg,添加回收率为73.5%～114.2%,变异系数3.9%～11.5%,与国标仪器方法检测结果的一致性较高。因此,该研究所建立的时间分辨荧光免疫层析检测方法在水产品氯霉素的快速检测工作中具有较高的应用价值和应用前景。     

酸度计法快速检测牛奶中残留的β-内酰胺酶

为了快速、准确地检测牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶的含量,利用β- 内酰胺酶分解青霉素产酸使牛奶pH 值下降的原理,对人工添加了β- 内酰胺酶的牛奶制品与青霉素反应后pH 值的下降规律进行研究。得到牛奶中残留的β- 内酰胺酶与青霉素反应的较适宜条件,从而获得快速检测牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶的方法。结果确定牛奶制品中残留的β- 内酰胺酶与青霉素反应的适宜条件为温度33℃、底物质量浓度10mg/mL,检测时间仅为60min。此方法对液态纯牛奶中β- 内酰胺酶的最低检出限为8.92U/mL。     

CdTe量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗

以巯基乙酸作为稳定剂,利用水热反应制备了水溶性的高荧光CdTe量子点,量子产率为54.961%。研究了该量子点在1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的作用下与抗克伦特罗抗体的共价连接。结果表明：该量子点与克伦特罗抗体连接后体系的荧光强度和吸光度均增强,且峰位均未发生明显移动,F/P值为4.20。将该偶联反应物CdTe-Anti CLE pAb作为荧光标记物,组装出一种用于检测克伦特罗的荧光免疫试纸条,最低检测限达0.5 μg/L,与酶联免疫吸附法进行对比,该试纸条能够实现对克伦特罗的快速检测。     

动物尿液中沙丁胺醇残留快速检测

探索一种动物尿液样品沙丁胺醇残留的快速检测方法。分别研究提取溶剂、β-环糊精与小分子醇的协同增敏作用和pH值对检测结果的影响,对该方法的选择性、线性方程、精密度和回收率以及检出限进行考察。结果表明：最佳提取溶剂为异丁醇,β-环糊精浓度为5mmoL/L,添加4%(V/V)的乙醇之后,能够明显增加沙丁胺醇荧光强度,最佳pH9;该方法的精密度相对标准偏差、回收率以及检出限分别为0.13%、96.57%、0.8μg/L。该动物尿液中沙丁胺醇残留的荧光光度检测方法,整个过程只需10～15min,操作方便,适合于现场检测。     

利用F0F1-ATPase分子马达生物传感器检测食品中的副溶血性弧菌

利用载色体上的F0F1-ATPase分子马达生物传感器对副溶血性弧菌检测快速检测。在ATP合酶的ε亚基上连接ε亚基抗体-生物素-链霉亲和素-生物素-toxR探针,将待测副溶血性弧菌标准菌株和阴性对照分别与生物传感器结合后,比较其催化ATP合成30min后的ATP产生量,可以对副溶血性弧菌的DNA进行检测。ATP合成的多寡可以通过环境中H+的量进行测量,而H+的多寡通过F-DHPE所体现的荧光强度大小来获得。结果表明,chro toxR的质量浓度在0.156mg/mL,副溶血性弧菌DNA质量浓度在40ng/mL时为最适检出条件。通过与实际检测样品的传统检测方法及聚合酶链式反应检测方法对照,具有良好的符合性。     

β-伴大豆球蛋白天然活性亚基的分离纯化

本研究将离子交换层析和金属螯合亲和层析方法相结合,建立了系统的分离纯化β-伴大豆球蛋白天然状态亚基的方法,通过梯度脲透析复性,使纯化亚基恢复天然构象。利用β-伴大豆球蛋白免疫动物制备抗血清对纯化亚基的免疫活性进行检测。结果表明：离子交换层析结合金属螯合亲和层析方法可以有效地纯化β-伴大豆球蛋白的α、α＇和β亚基,该方法产率高,制备的亚基纯度好,而且能与抗β伴大豆球蛋白血清特异性结合,表明提纯的亚基具有免疫活性。     

免疫亲和柱-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物

建立免疫亲和柱同时净化-高效液相色谱法测定牛奶中氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物（α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮）残留量的方法。样品经免疫亲和柱净化与富集后,用高效液相色谱-紫外检测器检测。采用Cloversil-C18反相柱分离,流动相为乙腈-甲醇-水溶液,检测波长为265 nm。结果表明,牛奶中添加氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物的回收率在74%～101%,且相对标准偏差均小于7%。氯霉素的检出限为0.02 μg/L,玉米赤霉醇及其类似物的检出限分别为α-玉米赤霉醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉醇0.03 μg/L、α-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、β-玉米赤霉烯醇0.03 μg/L、玉米赤霉酮0.04 μg/L和玉米赤霉烯酮0.05 μg/L。该方法灵敏度高、重复性好,提高了检测速率,可满足牛奶样品中痕量氯霉素和玉米赤霉醇及其类似物残留的测定。     

二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建

为构建一种食品残留检测用二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体(sdsFvCAP)。以抗氯霉素抗体可变区基因为模板,通过引物突变PCR 在轻链和重链的可变区分别引入一个半胱氨酸定点突变,以重叠延伸PCR 组装成sdsFvCAP。在大肠杆菌系统强启动子T7 驱动下,sdsFvCAP 基因不能单独表达,而通过同义突变降低其5＇端序列GC 含量则可实现高效表达。表达产物主要以包涵体形式存在,经β- 环糊精分子伴侣系统复性可获得亲和力与母本抗体相似的sdsFvCAP。所构建的sdsFvCAP 具有取代单克隆抗体用于氯霉素残留检测的潜力。     

三元超分子荧光增敏快速检测黄曲霉毒素M1

根据黄曲霉毒素M1（aflatoxin M1,AFM1）的荧光特性,研究β-环糊精（β-cyclodextrin,β-CD）及其衍生物（β-CDs）、金属盐（Hg2＋）与AFM1形成的三元超分子体系及对AFM1荧光增强作用,并探索超分子包合物形成的机理。甲基-β-CD-Hg2＋-AFM1三元体系中,当溶剂组成为体积分数20%甲醇溶液,Hg2＋、M-β-CD与AFM1物质的量比分别为6.6×104∶1、5.80×105∶1时,荧光增强倍数可达到4.5 倍。光谱法、热力学方法表明AFM1能进入M-β-CD空腔,从而减少荧光淬灭,增强荧光检测的灵敏度。利用Benesi-Hildebrand双倒数法和Van’t Hoff热力学方程研究超分子体系的包合常数与热力学常数,初步探讨超分子反应机理。该荧光增敏技术检测AFM1,在0.01～2.00 μg/L范围内分析线性良好,相关系数R2为0.999 2,检出限为0.002 6 μg/L。这种衍生方法具有灵敏、简单、高效、经济等优点,乳品中除铁元素以外的大多数强化微量元素对测定无干扰作用,可应用于奶制品中AFM1的快速检测。     

番茄及其制品中全反式番茄红素及bate-胡萝卜素含量的C30-HPLC内标法定量分析

目的：建立C30-HPLC 内标法对番茄及其制品中全反式番茄红素和β- 胡萝卜素进行同步定量检测方法。方法：色谱条件：固定相：YMC Carotenoid column C30 色谱柱 (4.6mm × 250mm,5μm);流动相A：乙腈:甲醇(3:1,V/V);流动相B：甲基叔丁基醚(MTBE);流动相A 与B 中分别添加体积分数0.05% 的三乙胺;洗脱条件：B 在0～10min 内保持30%,在10～20min 内,B 由30% 线性增至90%,20～30min 内B 维持在90%;流速：1mL/min;色谱图检测波长470nm 和450nm;进样量：20μL;柱温：室温。内标物为全反式-8'- 阿朴-8'-β- 胡萝卜素醛。结果：此方法的最小定量限为0.01μg/mL。在0.3～0.6μg 范围内,内标物对全反式番茄红素和β-胡萝卜素的相对校正因子分别为1.36 和1.22,重复性RSD 分别为小于0.50%和0.70%,加样回收率均在99.00% 以上。结论：应用本方法可对番茄及其制品中的全反式番茄红素和β- 胡萝卜素进行定量分析。     

基于主成分分析法的安溪铁观音香气质量评价模型的构建

从4个季节(每个季节两个等级)共8个安溪铁观音茶样中提取并分离出74种香气组分。通过主成分分析法鉴定出安溪铁观音中的主要特征香气成分,它们分别是：橙花叔醇、法呢烯、吲哚、苯乙醇、反-2-己烯醛、壬醛、苯乙醛、亚油酸甲酯、亚麻酸甲酯、棕榈酸甲酯、顺-己酸-3-己烯酯、苯甲酸-3-己烯-1-醇酯、辛酸-2-苯乙酯、5-正丁基-δ-戊内酯、顺式茉莉酮、法尼基丙酮、棕榈酸、香叶基芳樟醇异构体。利用主成分分析法,基于综合评价函数F＝β1F1＋β2F2＋…＋βkFk构建了安溪铁观音香气质量的评价模型,以不同特征值的方差贡献率βi(i＝1,2,…,k)为加权系数,利用所建立的模型计算各样本得分,然后进行排序评价各个茶样的香气质量。通过感官评价法进一步对模型评价结果进行了检验,结果显示两种方法具有很好的一致性,表明所建立的方法是可行的。     

高效液相色谱法测定黄酒中的β-苯乙醇

建立一种采用反相高效液相色谱法测定黄酒中β- 苯乙醇的方法。采用反相C18 色谱柱Synergi Hrdro-RP C18(4.6mm × 250mm,4μm),以甲醇- 水为流动相(50:50,V/V),流速1ml/min,紫外检测器,检测波长210nm,对黄酒中的β- 苯乙醇进行检测。结果表明,在5.00～30.00mg/L 添加量范围内,回收率水平在99.5%～99.8% 之间,相对标准偏差为0.6% (n = 6),方法的检出限为0.05mg/L,线性范围为0.5～50mg/L(r = 0.9999),测定结果与标准气相色谱方法基本相同。所建立的方法可以作为黄酒中β- 苯乙醇的检测方法。     

环糊精及肽配体介导的毒死蜱非竞争检测模式

以毒死蜱作为对象,构建了一种由环糊精和肽配体介导的非竞争检测模式。首先利用分子模拟和光谱学方法对β-环糊精包合毒死蜱的效应进行了证实;然后将β-环糊精与牛血清蛋白进行偶联,并证实偶联状态的环糊精分子仍能包合毒死蜱;以β-环糊精-牛血清蛋白偶联产物为核心材料,从商品化的噬菌体展示线性十二肽库中筛选获得了5个可以特异识别环糊精-毒死蜱包合物的肽配体;最后,利用亲和力最强的肽配体(8#克隆)构建毒死蜱的非竞争检测模式,该检测模式能够特异性地识别毒死蜱,而对丙溴磷、除线磷和溴硫磷等结构类似农药分子无识别。本研究所构建的检测模式无需对小分子物质进行改造和固定,可为小分子化学污染物的快速检测提供新的参考。     

A simple sample preparation for simultaneous determination of chloramphenicol and its succinate esters in food products using high-performance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry

ABSTRACT

A simple method is described for the determination of chloramphenicol and its succinate esters in food products. Examination of food products using high-performance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry showed the presence not only of chloramphenicol but also of its succinate forms. A scheme is proposed for determining chloramphenicol and its succinate esters (calculated as chloramphenicol) in meat (beef, pork, poultry), milk, liver, kidney, eggs, fish and honey. Analytes are extracted from a 1.0 g sample with 5 ml acetonitrile. It was found that using the method of standard addition and diluting the extract with water leads to the elimination of matrix effects and also eliminates errors associated with peak splitting due to the separate elution of the differing forms of the analyte. Validation results were satisfactory, with recoveries from 85% to 111% (meat, milk, liver, kidney, eggs, fish and honey) and a relative standard deviation (RSD) lower than 13% for spiked levels of 0.3, 1.0 and 5 µg kg^–1. The limits of detection and quantification (calculated as chloramphenicol for all forms) were 0.1 and 0.3 µg kg^–1, respectively. The RSD of the results of the analysis was < 10%. The duration of the analysis was less than 1 h.