外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前应用最为广泛的蛋白表达系统之一,已成功表达了数百种外源蛋白。但不同外源蛋白的表达量差异较大,能够实现工业化生产的蛋白表达体系并不多,如何提高目的蛋白在该系统中的表达量有着重要的理论和现实意义。该文从发酵工艺方面对影响外源蛋白表达的各种因素做了具体阐述,主要包括培养基的选择与优化、发酵过程参数的控制、分泌型蛋白酶的降解抑制以及诱导型毕赤酵母的甲醇流加机制,旨在提高外源蛋白表达量。     

基于文献的毕赤酵母研究趋势分析

毕赤酵母作为一种表达外源蛋白以及积累代谢中间物的细胞工厂已经得到广泛应用。文献检索是分析毕赤酵母研究的重要手段。该文基于Web of Science数据库分析了毕赤酵母的文献数量变化、来源国家分布等,以阐明我国有关毕赤酵母的研究状况。同时,展望了毕赤酵母外源基因表达技术、发酵策略、过氧化物酶体吞噬等新研究动向。     

毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略

毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。     

低温诱导对毕赤酵母表达重组外源蛋白的影响

毕赤酵母表达系统是近年发展较为突出的表达系统之一.大量研究表明,低温诱导在毕赤酵母发酵过程中对促进细胞物质及能量代谢,提高胞内醇氧化酶活力及能量水平,降低细胞死亡率及蛋白酶作用有明显影响;此外,外源蛋白表达过程中的聚集与降解作用也与诱导温度有关.该文从诱导温度角度对重组毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展进行了综述.     

不同补料发酵方式对重组毕赤酵母高密度培养的影响

目的:研究5L发酵罐中葡萄糖补料方式对重组毕赤酵母高密度培养的影响,为大规模工业化生产奠定基础。方法:葡萄糖分批发酵阶段结束以后,以不同的流加策略流加补料培养基。结果:分批发酵初始葡萄糖最佳浓度为10g/L;采用间歇补料和恒速流加补料方式培养毕赤酵母,发酵结束后菌体细胞干重分别为33.2g/L和41.5g/L,而采用指数流加补料方式,发酵前期和发酵后期控制比生长速率分别为0.20h-1和0.15h-1,发酵结束后菌体细胞干重可达53.4g/L。结论:采用分阶段控制比生长速率的发酵策略,发酵结束后菌体细胞干重远远大于间歇补料和恒速流加补料发酵策略。      

毕赤酵母多基因组装系统的构建及其在2-苯乙醇合成中的应用

巴斯德毕赤酵母是一种优良的外源蛋白生产平台,近年来也被用于发酵生产高附加值化学品。为了使产品生产适应发酵工业的需要,常需要对毕赤酵母进行代谢改造,同时表达多个基因。该文设计并建立了一种毕赤酵母多基因组装系统,利用golden gate克隆实现多元件整合,并通过Cre-lox系统去除抗性标签。该系统可实现同时游离或整合表达多个基因,插入位点、启动子、终止子均可灵活调整。利用这一系统对毕赤酵母进行改造,用于发酵合成高价值化学品2-苯乙醇。通过游离表达比较不同来源的关键基因,并整合表达2-酮-3-脱氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸合酶ARO3、ARO4^K229L和ARO5,分支酸变位酶ARO7^G141S和预苯酸脱水酶PHA2基因,最终重组菌株PE-3合成了408.4 mg/L 2-苯乙醇,是出发菌株的10倍以上。该研究建立多基因组装的系统可用于毕赤酵母代谢工程,构建适用于发酵生产蛋白或其他代谢产物的重组菌株。     

基于乙醇在线测量的DO-Stat甘油流加策略稳定重组毕赤酵母生产猪α干扰素的性能

重组毕赤酵母发酵生产猪!干扰素(pIFN-!)过程性能不稳定,高密度细胞培养阶段的性能指标直接影响到甲醇诱导期的猪!干扰素表达水平。测定分析甲醇代谢关键酶基因的转录水平以及酶活,发现甘油流加培养末期乙醇的大量(超过6 g/L)和长期积累(超过4h)不可逆转地抑制醇氧化酶(AOX)的启动,是导致猪!干扰素无法正常表达、发酵生产不稳定的主要原因。为此,提出了基于乙醇在线测量的改良型甘油流加控制策略,该策略可以在保证细胞快速生长的同时、将乙醇浓度有效控制在2 g/L以下的水平。与传统DO-Stat甘油流加策略(策略A)相比较,改良型甘油流加策略(策略B)可以强化猪!干扰素的诱导表达性能、确保其发酵生产的稳定:1)相同诱导条件下(甲醇/山梨醇培养基流加体积比1∶1),两个发酵批次大猪!干扰素浓度比使用策略A时优批次的大值分别提高75.5%和29.8%;2)在合理改变诱导条件时(甲醇/山梨醇培养基流加体积比4∶1),大猪!干扰素浓度仍比使用策略A时优批次的大值提高38.9%。     

Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇流加的控制

在采用Muts 表型基因重组巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris)发酵生产血管生长抑制因子(angiostatin)的过程中 ,诱导表达阶段甲醇的质量浓度对血管生长抑制因子的表达至关重要 .因重组Muts 型巴斯德毕赤酵母利用甲醇极慢 ,按文献方法流加甲醇时 ,甲醇逐渐积累达 30 g/L ,血管生长抑制素表达水平仅为 4mg/L .采用甲醇检测与控制系统对甲醇流加进行反馈控制后 ,甲醇质量浓度可稳定控制在设定范围 .采用此系统控制诱导阶段的甲醇流加 ,同时手动流加适量甘油以促进细胞生长 ,血管生长抑制因子表达水平量最高可达 89mg/L .     

共表达HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡萄糖氧化酶的影响

通过增强不可折叠蛋白质响应(UPR)信号途径以及研究不同培养温度下的影响,来提高重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。影响毕赤酵母外源蛋白表达的因素,主要为内质网中的折叠速率以及不可折叠蛋白积累造成的胞内胁迫压力。通过共表达HAC1基因对不可折叠蛋白信号通路进行调控,摇瓶中改造菌株PP-G-HAC1胞外酶活达到161 U/m L,相比于原始重组葡萄糖氧化酶菌株提高了34%。进一步研究不同温度下过量表达HAC1基因对菌株的生长和分泌外源蛋白的影响,菌株PP-G-HAC1在3 L发酵罐中28℃培养,酶活达到1 008 U/m L,胞外重组蛋白质达到14.43 g/L,相比原始菌株在相同条件下提高了3.12倍。     

源于 GAP 启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比, 源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇, 表达时间短, 并且在高密度发酵时采用连续发酵模式, 因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述, 以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的研究

探讨重组巴斯德毕赤酵母工程菌发酵生产藻蓝蛋白的特性,以期能够通过基因工程和发酵工程技术大规模的生产活性重组藻蓝蛋白。先用甘油作碳源培养重组巴斯德毕赤酵母工程菌,达到一定生物量后,再用甲醇诱导外源重组藻蓝蛋白基因的表达,并测定了甘油浓度、细胞干重、细胞光密度和藻蓝蛋白含量的变化。结果表明:所获得的细胞干重最高达41.93g/L,细胞光密度最高为182.77,藻蓝蛋白的最高产量为61.20mg/L,分泌到胞外的藻蓝蛋白的最高产量为24.32mg/L。该研究为实现藻蓝蛋白的产业化生产奠定了良好的基础。     

提高重组表达体系相对活性促进外源蛋白表达:人干扰素毕赤酵母表达体系研究

以毕赤酵母KM71/IH的hIFNβ-HAS表达体系为研究对象,较为系统地研究了不同因素引起的细胞相对活性变化与毕赤酵母外源蛋白表达的相关性。结果表明:(1)细胞相对活性变化与外源蛋白的表达成正相关;(2)处在对数生长中后期的细胞相对活性最高,更适合用于外源蛋白的表达;(3)诱导阶段的环境因素直接影响诱导期细胞相对活性,合适的甲醇浓度、诱导pH及温度是维持细胞高活性,促进外源蛋白高表达的关键。对于hIFNβ-HAS表达体系最佳诱导条件为:以培养21～24h的细胞为诱导种子,初始甲醇浓度为2%(V/V),pH6.0,25℃,细胞活性维持在98%以上,hIFNβ-HSA表达量高达45.6mg/L,较优化前提高了62.3%。     

源于GAP启动子的毕赤酵母组成型表达系统的研究进展

巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用非常广泛的外源基因真核表达系统。与源于醇氧化酶启动子(pAOX1)的诱导型表达系统相比,源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)的毕赤酵母组成型表达系统在表达外源蛋白时不需使用甲醇,表达时间短,并且在高密度发酵时采用连续发酵模式,因此成为近年研究的热点。本文分别从pGAP表达载体的构建、碳源、基因拷贝数、信号序列、高密度发酵等方面对该表达系统进行了综述,以期为其在蛋白生产中的深入研究和应用提供参考。     

通用型毕赤酵母高密度培养策略的网络共享技术

甲醇营养型毕赤酵母是近年来广泛应用的一种外源蛋白表达系统。本课题组在前期研究中构建了一系列能够满足绝大多数毕赤酵母高密度发酵过程工艺控制需求的通用型控制策略:用于细胞培养期的改良型DO-Stat甘油流加策略;用于甲醇诱导期的“甲醇浓度受限-溶解氧浓度充足”诱导控制策略;用于甲醇诱导期的“甲醇浓度充足-溶氧浓度受限”诱导控制策略。然而,这些控制策略的推广需要极高的时间和人力成本。为此,本文开发了基于Django框架搭建的服务器程序,以实现通用型毕赤酵母高密度培养策略的网络共享,并依靠前期开发完成的客户端程序实现控制软件包与不同发酵设备之间的对接。在甲醇利用快型(methanol utilization plusphenotype,Mut+)毕赤酵母表达人血清白蛋白-人粒细胞集落刺激因子突变体融合蛋白(HSA-GCSF m)和甲醇利用慢型(methanol utilization slow phenotype,Mut S)毕赤酵母表达人源溶菌酶(hLYZ)实验中分别验证了以上通用型控制策略的网络共享功能。结果表明,Mut+型毕赤酵母诱导60 h后HSA-GCSF m的质量浓度达到532 mg/L;Mut S型毕赤酵母诱导69 h后总酶活达到84032.0 U/mg,对应的比酶活力为52884.0 U/mg;HSA-GCSF m产量和hLYZ活力均达到较优水平。     

一株膜璞毕赤酵母的生理特性及其代谢产物研究

从茅台酒入窖酒醅中分离得到一株膜璞毕赤酵母。对其在不同碳源、不同pH值、不同温度下的生长生理特性进行研究;并对其不同底物、不同温度条件下的液态发酵代谢产物进行分析,其主要代谢产物为酸、醇、酯以及一些特殊呈香物质。     

NH+4离子对重组毕赤酵母产华根霉脂肪酶发酵过程的影响

利用重组毕赤酵母在7 L的发酵罐中进行分批补料高密度发酵,考察不同NH4+质量浓度对毕赤酵母基因工程菌表达华根霉脂肪酶的影响。结果表明,补加(NH4)2SO4溶液维持NH4+质量浓度在7 g/L时华根霉脂肪酶酶活最高,分别是不补加(NH4)2SO4溶液、补加并维持NH4+质量浓度在5 g/L、10 g/L条件下的1.41、1.11、1.08倍,而且在该氮源质量浓度条件下,胞外总蛋白质质量浓度最高,达到5.61 g/L。通过分析不同氮源条件下发酵参数比生长速率、产物比形成速率和底物比消耗速率的差异,发现发酵维持NH4+质量浓度在7 g/L时,产物比形成速率和底物比消耗速率均较高,这与该条件下产酶水平最高相一致。研究结果表明,对毕赤酵母基因工程菌发酵过程中的氮源进行优化,能够明显促进外源蛋白质的表达。     

巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展

毕赤酵母生物表达系统已成功地表达了多种重组外源活性蛋白,广泛地被应用于能源、医疗、科学研究等方面的研究。综述了2008年以来毕赤酵母GS115基因组研究,以期从分子水平解释转录调控、表达调控及翻译后修饰等机理,进而解决毕赤酵母发酵过程中产量低、过糖基化等瓶颈。      

非甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶的条件优化

以1株表达木聚糖酶的重组毕赤酵母为试材,首先优化了甲醇诱导的培养条件,进而采用甲酸铵作为诱导剂,联合山梨醇或者甲醇诱导重组毕赤酵母表达木聚糖酶。结果表明,甲醇诱导时木聚糖酶活力最高达到3 403.8 U/mL,单位细胞浓度活力为97.5 U/mL OD600。甲酸铵诱导毕赤酵母醇氧化酶1启动子的强度为甲醇诱导时的40.9%。联合0.5%甲酸铵和0.5%山梨醇时木聚糖酶活力为2 032.0 U/mL,单位细胞浓度的木聚糖酶活力为甲醇诱导时的1.54倍。这表明甲酸铵可以作为非甲醇诱导剂诱导毕赤酵母表达外源蛋白,并且联合山梨醇可以使重组毕赤酵母高效表达外源蛋白。     

游离型质粒在毕赤酵母中表达人溶菌酶的研究

构建一种表达人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌。巴斯德毕赤酵母表达质粒多以整合型质粒为主,整合型毕赤酵母表达外源基因时,外源蛋白的表达量会随着基因整合拷贝数的增加而增加,而对于毕赤酵母而言,稳定的游离型载体更有利于进行外源基因突变文库的构建及高通量筛选。该文将来自乳酸克鲁维酵母中的自主复制序列(pARS)与酵母表达载体pPICZαA连接,得到游离型表达载体pPICZαA-pARS。将优化后的人溶菌酶基因hLYZ连接至该载体中,构建重组表达载体pPICZαA-hLYZ-pARS。重组载体经电转化以游离形式转入毕赤酵母菌株X33中。摇瓶发酵结果显示诱导72 h后,发酵上清液酶活性为340 U/mL。利用镍亲和层析从发酵上清液中纯化人溶菌酶,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定后纯化后的蛋白质量浓度为0.954 mg/mL。该研究成功构建了分泌表达具有生物活性的人溶菌酶的游离型毕赤酵母工程菌,为日后利用现代生物技术突变获得更高抗菌活性、更广抗菌谱人溶菌酶的研究奠定了基础。     

外源脂肪酶在毕氏酵母表面展示及发酵过程分析

分别考察基于絮凝素和凝集素2种不同展示系统,展示有外源脂肪酶CALB(Candidan Antarctica lipase B)的重组展示酵母的展示酶活、上清酶活,发现毕赤酵母作为宿主在外源脂肪酶展示过程会分泌目的蛋白至上清中,引起"外泄",进一步通过重组展示酵母外源蛋白鉴定、外源蛋白去糖基化、发酵过程中蛋白变化趋势观察,表明基于絮凝素系统的非共价锚定是引起展示过程中蛋白外泄比例过高的主要原因,研究为实现脂肪酶在毕赤酵母细胞的高效展示进而提高展示酶的催化效率提供了理论指导。