酱油发酵过程中细菌的分离鉴定及其特性与交互作用

本研究从高盐稀态酱油酱渣中筛选细菌菌株,对5株代表性菌株进行理化性质分析探明菌株生长特性,并在模型体系中研究其与酵母的交互作用对菌株繁殖及风味形成的影响。研究后发现,解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌具有更强的蛋白酶活力,而腐生葡萄球菌、克氏库克菌与约式不动杆菌有更强的生长活力与产酸能力。其中解淀粉芽孢杆菌的耐盐性最差,其生长量相较于无盐状态下降低98.5%。在细菌与酵母交互作用模型中,发现解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和腐生葡萄球菌与鲁氏酵母之间存在相互促进生长的作用。如解淀粉芽孢杆菌与酵母的数量分别提升约9.6倍,而腐生葡萄球菌与酵母分别提升约5.2倍。同时,克氏库克菌的单菌与混菌培养体系均具有较好风味特性,提升了乙酸、乙酸乙酯、苯乙醛、3-甲硫基丙醛和3-甲硫基-1-丙醇等香气物质,具有应用潜力。该研究将对酱油发酵中的风味调控提供理论依据。     

酱醪葡萄球菌的筛选及其对高盐稀态酱油发酵的影响

为了探明酱醪葡萄球菌对高盐稀态酱油发酵的影响，采集高盐稀态酱醪，以产酸为指标分离筛选并获得3株产酸性能良好的葡萄球菌JL04、JL15、JL17，16S rDNA测序结合生理生化特性分别鉴定为香料葡萄球菌、鱼发酵葡萄球菌和肉葡萄球菌。在高盐稀态酱油发酵第15天分别添加3株菌进行为期60 d的发酵，分析发酵过程中还原糖、总酸及氨态氮的变化，结果发现3株菌均能加快酱醪中还原糖的利用，提高总酸及氨态氮含量，其中JL04总酸最高，为15.61 g/L，JL17氨态氮最高，为9.31 g/L。HPLC定量分析添加JL04、JL15、JL17的发酵酱油中6种有机酸总含量，分别较对照组增加了37.53%，24.06%及25.90%，主要是乙酸、乳酸、琥珀酸含量增加。气相色谱-质谱联用分析添加3株菌发酵酱油的挥发性风味物质，结果发现酯类物质含量明显提高，其中JL04比对照组提高了116.09%，以乙酸酯类和乳酸酯类含量增加为主，与相应的有机酸含量增加呈正相关关系。感官评分显示:3株菌添加发酵可增进酱油的香气及滋味。高盐稀态酱醪中分离筛选的3株葡萄球菌具有代谢积累有机酸，促进相应酯类物质合成的特征，可作为赋予酱油适口酸感、丰富酱油滋味、增进酱油香气的风味菌应用于酱油发酵。     

酱醪贝莱斯芽胞杆菌四甲基吡嗪高产菌的选育及其发酵优化

为获得四甲基吡嗪(TTMP)高产发酵菌株，以酱醪中筛选的贝莱斯芽胞杆菌CS1.11为出发菌株，进行紫外诱变，以酪素平板水解圈直径及乙偶姻显色反应为指标进行初筛，以蒸煮豆粕和焙炒小麦为原料固态发酵TTMP进行复筛，得到3株突变株。蛋白酶、淀粉酶活力及乙偶姻合成能力研究表明，其中2株突变株CS1.11-32、CS1.11-33更优，其TTMP的积累量较出发菌株分别提升了47.64%，78.89%，适用于酱油发酵体系。对影响TTMP积累的炒麦添加量、加水量、接种量、发酵温度及搅拌次数进行2株菌的对比发酵研究，CS1.11-33显示出更优的TTMP积累能力。响应面试验优化得出CS1.11-33固态发酵积累TTMP的最佳发酵条件为:炒麦添加量44%，加水量29%，发酵温度37 ℃，接种量8%，发酵过程中不进行搅拌，在此条件下TTMP积累量最大达到1 895.08 mg/kg干基，是其优化前的2.6倍。酱醪贝莱斯芽胞杆菌TTMP高产株的选育及其发酵研究将为提高酱油中TTMP浓度、快速增强酱香及促进TTMP的功能性应用奠定基础。     

酱油酿造用耐盐产乙醇风味酵母的选育及其应用

为得到1株适用于酱油酿造的高耐盐产乙醇风味酵母,对前期从酱醪中筛选的鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)L6进行紫外诱变,2,3,5-氯化苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)平板筛选得到发酵能力强的突变株L6-1。质量分数10%NaCl的豆芽汁培养基发酵,乙醇积累达到体积分数2.71%,比出发菌株L6提高54.86%。16%NaCl的高盐稀态酱醪中添加突变株L6-1发酵90 d,乙醇积累量在酱醪发酵第45天达到最高,为1.00%,比对照组提高78.57%;采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用检测到L6-1添加组有47种挥发性风味物质,较L6添加组多20种,酯类、醇类(不含乙醇)、醛类、酚类、酮类物质分别比L6添加组多2、10、4、1、3种,其中乙酯类物质总量为605.64 ng/g,比L6添加组及未添加对照组发酵酱油分别提高6.79%及20.61%;主成分分析发现L6-1添加组的发酵酱油得分最高。耐盐产乙醇风味酵母L6-1在高盐稀态酱醪中除提高乙醇为主的醇类化合物种类和含量之外,还对酱油重要的香气成分酯类,特别是乙酯类物质的形成起到了重要的促进作用,在提高酱油醇香风味的同时有效提升了酱油风味的丰富度。     

耐盐米曲霉CICIM F0899在酱油酿造过程中的应用

耐高盐环境的蛋白酶对酱油工业有着积极作用。该实验对1株产耐盐蛋白酶的米曲霉CICIM F0899在高盐稀态酱油发酵过程中的作用进行了研究,并同沪酿3042进行了比较。结果表明,在酱醪发酵阶段,微生物代谢产酸使酱醪pH持续下降,影响了蛋白酶的活性,导致酱油中氨基态氮和风味物质含量的变化,在180天时氨基态氮含量达到0.62 g/100 mL,比沪酿3042高11.11%。利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)对挥发性成分进行了分析鉴定,检测出酱醪中7大类共49种挥发性化合物,其中酯类、杂环类化合物的含量明显高于沪酿3042,而醛类物质的含量相对较少。因此,米曲霉CICIM F0899在氨基态氮含量和风味组成方面都具有更加明显的优势。     

高盐稀态发酵与低盐固态发酵酱油中次生菌群分析

对高盐稀态工艺与低盐固态工艺发酵生产酱油过程中不同发酵时间及不同位置的酱醅(醪)的次生菌群进行分析研究.得到两种工艺中微生物类群及数量随时间的变化规律,并初步探讨其与酱油的风味、品质之间的关系.结果表明,高盐稀态工艺的总菌数要多于低盐固态工艺,其中前者的酵母菌数量为1.76×109个/g·酱醪,占总菌数的99%,约为后者的18 900倍;且前者毛油各项品质均优于后者.说明酱油的风味、品质与酱油发酵过程中菌群的数量有较大关系.     

耐盐酵母添加对高盐稀态酱醪风味成分的影响

采用蒸馏萃取法提取高盐稀态发酵法发酵结束后的酱醪中的挥发性成分,采用气相色谱进行分析。结果表明,不同时期分别添加3种耐盐酵母的高盐稀态酱醪所产生的风味成分均要多于未添加酵母的酱醪,尤其在第15天添加T酵母产生的风味物质要明显高于其他。在酱醪发酵的第15天添加T酵母使得异丁醛,乙酸乙酯,乙醇,异丁醇,正丁醇及异戊醇,乙酸含量明显提高,45天添加S酵母使HEMF的含量显著提高。表明,在酱油发酵过程中添加耐盐酵母的时间很重要,这可直接影响酱油中某些风味物质的产生及其相互的协调作用。     

高盐稀态酱醪中功能性酵母菌的筛选、鉴定及发酵特性

从高盐稀态酱醪中筛选酵母菌株,其中14 株分离鉴定的酵母菌株可分为4 个菌种,选择代表性菌株进行生理生化鉴定并探究其生长特性,并将分离的14 株酵母菌单独发酵产香,结合气相色谱-质谱和嗅闻感官评价,探究各菌株对酱油风味的功能作用。结果表明,胶红酵母和似平滑假丝酵母对酱油风味具有一定的提升效果,可能与2-苯乙酸乙酯、3-甲硫基-1-丙醇、2,6-二甲基吡嗪等物质含量的增加相关,为潜在风味功能酵母。而粉状米勒氏酵母和近平滑假丝酵母对酱油风味具有负面影响,特别是粉状米勒氏酵母,菌落表面干燥褶皱,其繁殖代谢将大幅提高酱油中2-辛酮、2-壬酮和1,2,3-三甲氧基苯的含量,带来明显的不良风味,是酱油风味的有害酵母。本研究明确了4 种不同酵母菌对酱油风味的作用差异,对酱油发酵的风味调控具有指导意义。     

蛋白酶固定化条件优化及在酱醪发酵中的应用

本文以海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、酶液与载体溶液体积比及固定时间为因素,优化中性蛋白酶固定化工艺,并将固定化中性蛋白酶凝胶颗粒应用于传统高盐稀态酱醪发酵,以缓解高渗透压环境对酶的胁迫作用,提高蛋白质利用率,缩短酿造周期。结果显示:当采用0.007 M海藻酸钠、0.27 M氯化钙,酶液与载体溶液体积比为12:30,固定2 h,固定化凝胶颗粒最稳定,相对酶活力最高;另外,酱醪发酵数据显示,酱醪总重17.5 kg,添加总酶量5.80 g(1000 U/g酶粉)时,外源游离蛋白酶和固定化蛋白酶试验组均能显著改善发酵过程各指标含量,平均缩短发酵时间20 d左右;与外源游离组相比,固定化试验组效果更加显著,蛋白质转化率较空白对照组与游离组分别提高达6.08%和1.88%。因此,在酱醪发酵过程添加固定化外源蛋白酶能有效提高高盐稀态酱油发酵蛋白质转化率,同时缩短发酵周期。     

甘氨酸甜菜碱及复合纤维素酶对酱油发酵的影响

将甘氨酸甜菜碱作为渗透压保护剂,于酱醪上罐时(0d)或酱醪发酵30d后添加到高盐稀态酱油发酵的酱醪中,同时添加外源复合纤维素酶,观察其对酱醪发酵的影响。结果表明：在酱醪上罐时(0d)或酱醪发酵30d后同时添加不同质量分数的甘氨酸甜菜碱(0.20%、0.30%)及质量分数0.15%的复合纤维素酶(105EGu/100g酱醪),均能有效提高发酵酱油中蛋白质转化率,达2.26%～7.92%。添加甘氨酸甜菜碱能显著改善高盐稀态发酵酱油头油品质,平均缩短发酵时间15d左右;另外,在酱醪发酵30d后再添加甘氨酸甜菜碱和外源复合纤维素酶其效果更佳,同0d时添加相比,蛋白质转化率平均提高了3.17%。     

解淀粉芽孢杆菌SWJS22和米曲霉混合制曲在酱油发酵中的应用

以解淀粉芽孢杆菌SWJS22和米曲霉为发酵菌株,考察米曲霉单独制曲发酵、米曲酶和解淀粉芽孢杆菌曲料混合发酵以及双菌种混合制曲发酵对酱油理化指标及风味的影响。结果表明:曲料混合发酵的酱油氨基酸转化率有较大提高,色率和色深物质均低于米曲霉单独制曲发酵的酱油和双菌种混合制曲发酵的酱油,曲料混合发酵酱油和双菌种混合制曲发酵的酱油谷氨酸含量有明显提高。采用气相色谱-质谱对比分析3种不同曲料发酵酱油的风味物质,结果表明:3种酱油的风味物质种类差别不明显,重要风味成分在3种酱油中均有检出,曲料混合发酵的酱油酸类物质的含量最低。     

Effect of different halophilic microbial fermentation patterns on the volatile compound profiles and sensory properties of soy sauce moromi

The effect of inoculated or co-cultured halophilic lactic bacteria (Tetragenococcus halophilus) and yeasts (Zygosaccharomyces rouxii and Candida versatilis) on the quality of soy sauce moromi was investigated. Results showed no significant change in the major physicochemical properties of soy sauce moromi such as amino nitrogen, total acid, and reducing sugar at the end of fermentation, whereas the composition of free amino acids slightly changed with different fermentation patterns. In the sample inoculated with T. halophilus, the concentration of proline and tryptophan decreased by 18.83 and 50.87 % compared with the blank sample, whereas tyrosine and histidine increased by 32.41 and 27.04 %. In the sample inoculated with Z. rouxii and C. versatilis, the concentration of bitter-tasting lysine, tyrosine, and phenylalanine increased by more than 20 %, and the concentration of tryptophan decreased by 56.71 %. The proportion of amino acids with sweet taste increased by 0.8 % through the co-culture of the three strains. Meanwhile, the total amount of volatile compounds increased by 117.66, 23.28, and 216.88 % in the T. halophilus inoculated sample, two yeast strain inoculated sample, and three strain inoculated sample, respectively. Increased odour activity values of the nine compounds that mainly contributed to the flavour of moromi ranged from 1 to 7.87 times in the three strain inoculated sample. These findings revealed that the co-culture of the three strains during moromi fermentation was beneficial to the improvement of flavour of soy sauce moromi.     

沉香型酒醅中产香芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析

从沉香型酒醅中分离产香芽孢杆菌并进行发酵风味分析。通过平板分离得到4株产香较好的芽孢杆菌,并进行16S rDNA序列分析和构建系统发育树,4株菌分别为阿式芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniform）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。其中地衣芽孢杆菌产蛋白酶和淀粉酶能力均为最强且最适生长温度为50 ℃。以玉米粉为底物进行单菌液态发酵,采用固相萃取和气相色谱-质谱法(SPME-GC-MS)分析发酵液中的风味物质,一共检测到24种风味物质,其优势产物主要为3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇和一些酸类等风味物质。由此而见,阿式芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌这4类菌对沉香型白酒风味的形成均具有重要作用。     

Effect of temperature on the stability of various peptidases during peptide-enriched soy sauce fermentation

We previously developed a peptide-enriched soy sauce-like seasoning called Fermented Soybean Seasoning (FSS) with high-temperature fermentation, and we have reported the antihypertensive effects of FSS. Seryl-tyrosine (Ser-Tyr) and glycyl-tyrosine (Gly-Tyr) were identified from FSS as active constituents in the antihypertensive effects. They were found to be particularly enriched in FSS; more so than in regular soy sauce. In the present study, we clarified one of the mechanisms underlying the accumulation of these bioactive peptides during high temperature soy sauce brewing. Crude enzyme extracts were prepared from model soy sauce mash (moromi) fermented at various temperatures. Leucine aminopeptidase-I, II, and seryl-tyrosine hydrolytic activity were found to decrease in the moromi incubated at the fermentation temperature of FSS whereas almost no decrease was observed in that of regular soy sauce. The concentrations of ACE inhibitory peptides, Ser-Tyr and Gly-Tyr, in the moromi incubated at high temperature were revealed to be higher than those at low temperature through quantitative LC-MS/MS analysis. These results suggested that the peptidases responsible for degrading low molecular weight bioactive peptides were inactivated during the high temperature fermentation, thus, these peptides would be likely to remain in the high temperature fermentation.     

芽孢杆菌的产酶特性及其对抗生素的耐受性

以4株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和2株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为研究对象,通过测定其成胞率、中性蛋白酶活性及对24种抗生素的耐受性,从中筛选优良芽孢杆菌。结果表明,从6株芽孢杆菌中筛选得到3株成胞率和产中性蛋白酶均较好的芽孢杆菌,分别为枯草芽孢杆菌BLCC1-0552、BLCC1-0615和地衣芽孢杆菌BLCC1-0441,液体发酵24 h后,成胞率较高,均达到98%;中性蛋白酶活性分别为90.58 U/mL、100.32 U/mL和24.72 U/mL。其中,枯草芽孢杆菌BLCC1-0615固体发酵玉米-豆粕型常规饲料产中性蛋白酶活力最高,发酵48 h时达到2 154.49 U/g。3株芽孢杆菌对抗生素的耐受性不一致,其中枯草芽孢杆菌BLCC1-0615对24种抗生素中的17种表现敏感,敏感率最高为70.83%。因此,确定优良菌株为枯草芽孢杆菌BLCC1-0615,其成胞率、产中性蛋白酶能力好及对抗生素耐受性较低,具有作为饲料添加剂应用于畜禽饲料中的潜力。     

酱油的罐式与池式发酵过程中关键呈味物质对比分析

从发酵罐和发酵池中选取发酵过程中的酱油进行中性蛋白酶活力、氨基酸态氮含量、游离氨基酸含量、pH值、总酸含量、有机酸含量、还原糖含量、淀粉酶活力和食盐含量的检测与分析。结果表明：池式发酵酱油的中性蛋白酶活力、氨基酸态氮含量、氨基酸总量、有机酸总量、淀粉酶活力、还原糖含量、总酸含量和pH值都高于罐式发酵酱油;食盐含量则是罐式酱油更多;其中鲜味氨基酸在发酵12 d后池式酱油的含量就高于罐式酱油的含量,尤其是池式酱油的谷氨酸在发酵45 d时已达到10.42 g/kg,而罐式酱油的谷氨酸含量仅7.91 g/kg;两种方式发酵的酱油都能检测出7种有机酸,且含量较高的两种有机酸分别是乳酸和乙酸;在发酵结束时池式酱油的还原糖含量比罐式酱油的还原糖含量高1.01 g/100 g;池式酱油的食盐含量比罐式酱油的食盐含量低0.90 g/100 g,说明在关键呈味物质上池式发酵酱油优于罐式发酵酱油。     

不同菌株对发酵大豆后熟期间品质特性的影响

为研究利用细菌和霉菌进行混合发酵的不同效果,开发新的混菌发酵工艺,本研究采用不同接种方式,得到3个单一菌株发酵样品,4个混合菌株发酵的样品,研究不同菌株对发酵大豆品质特性的影响。按照韩国清麴酱的方法,利用Bacillus subtilis菌株发酵制得样品B,按照豆豉的发酵方法利用Aspergillus oryzae和Mucor racemosus菌株制得样品A和M。混合菌株发酵样品中依据两种菌株接种的顺序不同,分别制得AB、BA、MB和BM。结果表明,后熟0~9 d期间,样品B的蛋白酶活性最高(257.32±3.04)U/g;样品M的还原糖在后熟第1 d达到1.17%,高于其他样品。样品A和MB氨基态氮含量较高,样品B中测得铵态氮含量最高。所有样品的pH呈下降趋势,而滴定酸度变化范围则相反,从0.02%上升到0.19%。在后熟9 d期间,各样品色度中的L*值呈持续下降趋势,样品MB褐变现象明显。在7个实验组中,样品MB通过混菌发酵工艺提高了发酵大豆的品质特性,验证了利用细菌和霉菌进行混菌发酵技术能够改善发酵大豆的品质特性。     

酸性蛋白酶对高盐稀态酱油发酵的影响

以高盐稀态发酵酱油为研究对象,以未添加酸性蛋白酶的样品为对照组（K）,在酱油发酵初期（0 d）添加酸性蛋白酶（1‰）的样品为实验组（S）,通过分析发酵过程（1～62 d）中酸性和中性蛋白酶活力、pH、总酸含量、氨基酸态氨含量和游离氨基酸含量的变化及生酱油的呈味氨基酸含量,考察添加外源酸性蛋白酶对酱油发酵的影响。结果表明,S组的酸性蛋白酶和中性蛋白酶活力分别为K组的2.9倍和2.1倍。发酵结束时,与K组相比,S组酱油的pH下降至4.50、总酸、氨基酸态氮含量分别增加36.71%、16.49%;游离氨基酸总含量降低13.64%,生酱油呈鲜味的谷氨酸含量由11.52 g/L降至1.26 g/L。表明酸性蛋白酶虽然能够提高原料利用率,但对酱油滋味也有一定影响。     

产低温蛋白酶动性球菌的筛选及其在低盐鱼露发酵中的应用

探究4?株从传统虾酱中筛选出的动性球菌对低盐鱼露品质的影响。采用水解透明圈的方法,从传统发酵虾酱中筛选并分离出4?株在低温条件（15?℃）下具有蛋白酶活性的菌株。通过酶活力的测定（40?℃）进行复筛,其中编号为XJ11的菌株酶活力最高,为（10.07±0.11）U/mL。通过形态学观察和16S?rRNA序列比对,鉴定4?株菌均属于动性球菌（Planococcus）,分别命名为P. maritimus XJ2、P. plakortidis XJ10、P. dechangensis XJ11和P. rifietoensis XJ12。4?株动性球菌在低温、低盐、碱性的环境中生长良好。动性球菌所产的蛋白酶在40?℃、pH?9.0时有最高酶活力,并具有一定的耐盐性。将4?株动性球菌作为起始发酵剂（1∶1∶1∶1,3%）应用到低盐鱼露的发酵中,结果表明：添加发酵剂的低盐鱼露氨基酸态氮质量浓度（（1.33±0.08）g/100?mL）极显著高于未添加发酵剂的鱼露（（0.89±0.02）g/100?mL,P＜0.01）,并且主要的挥发性风味物质含量也高于对照组,例如醇类、酮类、酸类、酯类和吡嗪。因此,该发酵剂能够提高低盐鱼露的氨基酸态氮含量并有效改善风味。