与特定乳酸菌共培养对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的诱导作用

植物乳杆菌KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养后,测定培养物的抑菌活性和活菌数,判断与乳酸菌共培养对植物乳杆菌细菌素合成的影响及细菌素合成与菌体密度的关系。结果表明：植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351、罗伊氏乳杆菌KLDS1.0736这4株菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养后,抑菌活性显著增加(P＜0.01)。与罗伊氏乳杆菌共培养过程中细菌素的抑菌活性与植物乳杆菌KLDS1.0391的细胞密度呈现明显的正相关性,并且发现只有活的诱导菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养才能够诱导细菌素的合成。     

超滤法分离植物乳杆菌KLDS1.0391发酵液中的细菌素

采用截留分子质量1kD和3kD的超滤膜分离植物乳杆菌KLDS1.0391发酵液中的细菌素,研究主要超滤操作参数对膜通量和细菌素效价的影响,确定超滤法分离细菌素的条件。结果表明：超滤法分离物乳杆菌KLDS1.0391发酵液中细菌素的最适条件为：采用截留分子质量为3kD的超滤膜进行分离,超滤温度30℃,操作压力0.140MPa,超滤时间120min,细菌素的效价由574.99IU/mL提高到1849.40IU/mL,比活力为185.96IU/mg,纯化倍数为8.0,浓缩倍数为3.0。     

植物乳杆菌KLDS1.0391在酸奶体系中的细菌素产生特点

植物乳杆菌KLDS1.0391能够合成细菌素,也是益生菌,在食品中既可作为益生菌使用,也可作为辅助发酵剂用于生物防控,该研究主要考察了KLDS1.0391菌株在酸奶体系中细菌素的产生特点。研究结果表明,在发酵的6 h期间,抑菌活性随发酵时间延长而增强,发酵结束时,添加植物乳杆菌KLDS1.0391酸奶组的抑菌活性显著高于仅使用酸奶发酵剂的对照组(P<0.01)。与对照组相比,加入辅助发酵剂的实验组的感官品质未发生明显的变化。植物乳杆菌KLDS1.0391具备开发益生酸奶的潜力。     

AI-2的体外合成及其对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的影响

本文采用单因素实验,优化AI-2合成的孵育温度、pH、酶浓度以及孵育时间。利用优化的合成条件,成功合成具有生物活性的AI-2,活性约为阳性对照的2倍。添加合成的AI-2到MRS培养基中,研究AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391生长和细菌素合成的影响,并采用实时荧光定量PCR分析培养15 h的植物乳杆菌KLDS1.0391的细菌素结构基因pln EF的转录水平。结果表明:AI-2合成的最优条件为:0.5 mg/m L Pfs蛋白、1.0 mg/m L Lux S蛋白、2 mmol/L SAH,p H7.5,37℃孵育5 h。添加合成的AI-2对植物乳杆菌的生长无明显影响;培养3 h后,相同培养时间时添加AI-2的实验组对枯草芽孢杆菌ATCC6633的抑菌圈直径显著高于空白对照和阴性对照组(p0.01);添加AI-2的实验组的pln EF基因的表达量上调至空白对照的2.89倍。本研究成功优化AI-2的体外合成条件;添加合成的AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成有促进作用,且这种促进作用可能与pln EF基因转录水平上调有关。     

pfs基因原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

以植物乳杆菌KLDS1.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到pfs基因,与Gen Bank中的序列对比发现同源性为99%。将目的基因与表达载体p QE-30连接,并将重组质粒p QE-30-pfs转化到E.coli M15中。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在全菌体蛋白中含有一条明显的特异性蛋白条带,大小约为27.4ku。经Ni-NTA纯化系统纯化后,在SDS-PAGE凝胶电泳图上获得纯化产物的条带。结果表明,原核表达载体p QE-30-pfs构建成功,且Pfs蛋白在大肠杆菌中成功表达,采用Ni-NTA纯化系统成功纯化了重组蛋白Pfs,为体外合成AI-2(Autoinducer-2)奠定了基础。     

luxS基因对盐胁迫下植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响

以植物乳杆菌KLDS1.0391野生株及其luxS基因缺失突变株为研究对象,探究luxS基因对该菌盐耐受能力的影响,并测定在0%、2%、3%、4%和6%质量分数NaCl胁迫条件下,luxS基因缺失对该菌生长及细菌素合成的影响,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术在转录水平上测定该菌细菌素合成相关基因的表达水平。结果表明：随NaCl质量分数的升高,2 株菌的存活率均逐渐下降,当NaCl质量分数大于3%时,相同条件下野生株对盐的耐受能力显著强于突变株（P＜0.05）;除此之外,NaCl质量分数越高,菌株进入稳定期的时间越向后延迟,luxS基因缺失突变株在各NaCl质量分数下生长及细菌素合成能力均显著弱于野生株（P＜0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,当培养至稳定期24 h时,细菌素结构基因plnEF以及双组分调节基因plnD和plNC8HK均因luxS基因的缺失,表达显著下调（P＜0.05）。因此,luxS基因缺失显著降低植物乳杆菌KLDS1.0391盐耐受能力,并且在NaCl胁迫条件下,该菌生长及细菌素合成能力也因luxS基因缺失而显著下降。     

胆盐胁迫对植物乳杆菌KLDS1.0391葡萄糖代谢和细菌素合成的影响

为研究胆盐胁迫是否显著影响植物乳杆菌KLDS1.0391的葡萄糖代谢和细菌素合成能力,将菌株在不同浓度的胆盐中胁迫一定时间,重新接种于MRS培养基中继续培养24 h后,测定活菌数量、残糖量、乳酸产量、乳酸脱氢酶活性及其上清液的抑菌能力。结果表明:植物乳杆菌KLDS1.0391在含0.1%和0.2%胆盐的MRS培养基中胁迫0.5 h和2.0 h,再培养24 h后,活菌数量、葡萄糖利用率、代谢产物乳酸产量和乳酸脱氢酶活性均显著提高,抑菌圈直径无明显变化;而在含0.5%胆盐的MRS培养基中胁迫2.0 h,再培养24 h后,所有检测值均较对照组显著下降。菌株经低含量胆盐(≤0.2%)胁迫,再培养后的活菌数量和葡萄糖代谢能力提高,而经高含量胆盐(≥0.4%)胁迫后,活菌数量、葡萄糖代谢和细菌素合成能力均下降。     

产细菌素乳酸菌的筛选及对农家干酪保质期的影响

从实验室保存的7 株乳酸菌中,经分离纯化,以金黄色葡萄球菌为指示菌,筛选获得1 株高产细菌素的菌株KLDS 1.0338,排除有机酸和过氧化氢的干扰以及蛋白酶敏感性实验,确定抑菌作用是由细菌素产生的。通过菌株形态学分析,生理生化及16S rDNA分析鉴定菌株KLDS 1.0338为干酪乳杆菌ATCC 334。进一步利用该菌株制作农家干酪,考察4 ℃贮藏期间干酪的变化,添加KLDS 1.0338干酪乳杆菌的实验组抑菌活性显著大于未添加KLDS 1.0338干酪乳杆菌组（P＜0.01）,实验组的pH值下降平缓,可以有效延长农家干酪的货架期,并保持产品原有的色泽、风味、质构等感官特性。     

植物乳杆菌KLDS1.0391所产细菌素的纯化

植物乳杆菌KLDS1.0391的无细胞上清液首先经过饱和度为70%的硫酸铵沉淀,收集的沉淀溶于1/40体积0.02mol/L的乙酸钠缓冲液(pH 6.5),复溶后的样品采用填充SP SepharoseTMFast Flow的COLUMN XK 16/20层析柱进行阳离子交换纯化,之后采用SOURCE 5RPC ST 4.6/100层析柱进行反相纯化。结果表明,具有抑菌活性的细菌素纯化样品经高效液相色谱检测,显示为单峰,说明其基本得到纯化,经Tricine-SDS-PAGE分析和MALDI-TOF质谱,判定该细菌素的分子质量约为1770D。     

环境胁迫调控植物乳杆菌细菌素合成的研究进展

植物乳杆菌作为具有重要经济价值的乳酸菌被广泛应用于食品发酵与保鲜领域,由于其代谢过程中会产生具有广谱抑菌特性、对热稳定且易被蛋白酶水解的细菌素,因此有作为天然食品生物防腐剂的较大应用潜力。研究表明,在发酵过程中菌体的生长和细菌素的合成受多种环境因素如盐胁迫、酸胁迫、氧胁迫及低高温胁迫的影响,但目前环境因素调节信号分子产生以及调控相关基因合成细菌素的具体机制仍然有待研究,另一方面,通用的调控通路还未被发现。因此,本文介绍了植物乳杆菌抵御胁迫的反应机制并详细阐述了环境胁迫下与细菌素合成密切相关的调控基因和重要调控蛋白,为食品发酵加工过程中合理控制发酵条件,促进细菌素合成从而延长食品货架期提供理论依据。     

氨基酸对植物乳杆菌KLDS1.0391生长及细菌素合成的影响

为探究氨基酸对植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响，调节化学成分确定培养基中的氨基酸组成，培养植物乳杆菌KLDS1.0391，采用高效液相色谱法测定乳酸含量，通过实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析细菌素和氨基酸合成相关基因的表达。结果表明，天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺的缺失导致该菌生长能力和细菌素合成量均显著降低（P＜0.05）；谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸及缬氨酸的缺失仅影响菌体生长，对细菌素合成无明显影响；而赖氨酸胁迫（缺失及过量）对菌体的生长影响很小，但却显著影响细菌素的合成。色谱结果显示，赖氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸及苏氨酸单缺失后乳酸含量升高。real-time PCR结果表明，细菌素合成相关基因plnEF、plnD及plNC8HK因赖氨酸的缺失表达显著下调（P＜0.05），而上述基因在外源赖氨酸质量浓度达到2.0 g/L前，上调水平随赖氨酸添加量的增大而增大。氨基酸合成关键基因dapG、yclM 因赖氨酸缺失表达显著上调，相反，上述基因在赖氨酸质量浓度为2.0 g/L时表达量显著下调（P＜0.05）。由上述研究结果推测，当赖氨酸缺失时，菌体通过上调基因dapG 和yclM 的表达以合成多种蛋白质保证其正常生长代谢，赖氨酸可正向诱导该菌细菌素合成，其可能作为细菌素合成底物发挥作用。     

一株产细菌素植物乳杆菌高密度发酵培养基的筛选及其在酸奶中的应用

目的:优化用于高密度发酵产细菌素的植物乳杆菌KLDS 1.0391的经济有效培养基,旨在生产具有益生作用的辅助发酵剂。方法:以发酵液中活菌数量和抑菌效果为指标,比较不同水解度的脱脂乳粉、乳清粉、麦麸,以及玉米浆粉的发酵效果,制备冻干形式的植物乳杆菌直投式发酵剂,将其添加至酸奶中,评价其对酸奶发酵时间、pH、滴定酸度、粘度和感官评价的影响,进而确定其在酸奶中应用的可行性。结果:确定脱脂乳粉、乳清粉和麦麸培养基的最佳水解度分别为15%、15%和20%;植物乳杆菌KLDS 1.0391在玉米浆粉培养基中获得的发酵效果最佳,活菌数量达到9.53 lg CFU/mL,抑菌圈直径达到12.69 mm。植物乳杆菌直投式菌种的添加对酸奶发酵时间和感官评价无显著影响(P>0.05),酸奶粘度下降,但可以缓解酸奶的后酸化程度。通过优化得到植物乳杆菌KLDS 1.0391高密度发酵的廉价培养基为:4%玉米浆粉,同时补充2%葡萄糖和0.1% Tween-80。结论:制得的植物乳杆菌直投式发酵剂可应用于酸奶生产中。     

The role of plNC8HK-plnD genes in bacteriocin production in Lactobacillus plantarum KLDS1.0391

The function of plNC8HK gene and plnD gene on the bacteriocin production of Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 was studied. The results of bioinformatics analysis showed that PlNC8HK protein was a histidine protein kinase and a cytoplasmic membrane protein with six transmembrane helices. PlnD protein was a response regulator of the LytR/AlgR family. Quantitative real-time PCR revealed that plNC8HK and plnD genes of L. plantarum KLDS1.0391 were up-regulated significantly (P < 0.01) when L. plantarum KLDS1.0391 co-cultured with Lactobacillus helveticus KLDS1.9207. The plNC8HK-plnD mutant was also constructed. The change of antibacterial activity, AI-2 activity and cell number of plNC8HK-plnD mutant in co-culture and mono-culture demonstrated that plNC8HK and plnD genes were essential for bacteriocin production in L. plantarum KLDS1.0391, and the increase of bacteriocin production correlated closely with plNC8HK and plnD genes in co-culture. These results are beneficial to understand the role of two components system in the bacteriocin production of L. plantarum.     

响应面法优化植物乳杆菌代谢产细菌素的发酵条件

为提高一株分离自内蒙古传统发酵稀奶油“焦克”中的植物乳杆菌KLDS1.0391 代谢产细菌素量,以中性蛋白酶水解脱脂乳为培养基,以枯草芽孢杆菌为指示菌,以抑菌圈直径为考察指标,在单因素试验的基础上,采用响应面法优化发酵pH 值、温度以及接种量。结果表明：对该菌代谢产细菌素的活性影响大小依次为：发酵pH值＞接种量＞发酵温度;最优发酵条件为：pH5.1、发酵温度33℃、接种量1%。在此条件下,发酵液的抑菌圈直径为15.00mm,细菌素的效价为601.32IU/mL,较优化前提高了43.08%。在最优发酵条件下获得的实验结果与模型预测值吻合,说明所建立的模型是切实可行的。     

植物乳杆菌NP_785232蛋白N端两个特定结构域在大肠杆菌中的诱导表达

以植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232为研究对象,采用外源重组表达的方法大量制备其前两个结构域。应用聚合酶链式反应方法克隆NP_785232蛋白N端的前两个结构域,将克隆获得的片段连入表达载体pET30a中构建重组质粒pET30a/N2,该重组质粒转化大肠杆菌后,用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷诱导重组菌,重组蛋白经HisTrap柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对电泳获得的目的大小的片段进行质谱鉴定。结果表明：获得的重组蛋白与NP_785232蛋白N端的前两个结构域完全相同。通过大肠杆菌表达系统可以有效表达植物乳杆菌KLDS1.0320的候选表面黏附蛋白NP_785232 N端的前两个结构域。     

微生物共培养对植物乳杆菌RX-8合成细菌素的诱导作用

目的:植物乳杆菌RX-8分离自中国传统泡菜,可代谢合成Ⅱb类细菌素plantaricin EF.该细菌素抑菌谱广,加工应用特性良好,有作为天然食品生物防腐剂的巨大潜力,然而,其合成水平较低,工业化生产及应用严重受限.本研究探讨外源微生物共培养作为环境刺激因子,诱导菌株RX-8高效合成plantaricin EF的可行性...