固定化γ-谷氨酰转肽酶催化合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

以环氧基树脂Eupergit C250L为载体对B.subtilis NX-2 GGT进行了共价固定化.固定化酶的最适作用pH为9.0,最适作用温度为60℃.固定化酶的热稳定性和贮存稳定性均较游离酶有显著的提高,经100 d 20个批次转化后,固定化残余酶活仍能保持初始值的80%左右.以固定化酶为催化剂,在反应条件为L-谷氨酰胺(Gln)20 mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-Bzl-cys)20 mmol/L、酶浓度0.0375 U/mL和pH 9.0条件下,40℃水浴反应22 h,转肽产物S-苄基-y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)得率为4.3 mmol/L,较游离酶提高了11.96%.S-Bzl-GGC经酸解脱除保护基后可得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸,产物纯度可达94.1%.     

酶法制备S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸的动力学模型

以Bacillus subtilis NX-2产γ-谷氨酰转肽酶(GGT)为催化荆,以L-谷氨酰胺(L-Gln)为γ-谷氨酰基供体,S-苄基-L-半胱氨酸(S-Bal-Cys)为受体,催化合成了S-苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC).在反应机理分析的基础上,建立了定量描述该过程的动力学模型,模型计算值和实测值能较好吻合,平均相对误差为5.57%.通过模型分析得知,供体浓度的增加有利于转肽反应,但更多的是自转肽反应;受体浓度增加对提高转肽产物S-Bzl-GGC有一定的作用,对自转肽反应几乎没有影响;酶含量增加提高了反应速率,但不提高转肽产物的最大浓度.     

有序介孔TiO_2固载γ-谷氨酰转肽酶催化合成S-bzl-γ-Glutamyl-L-Cysteine

以有序介孔TiO2(OM-TiO2)为载体对B.subtilis NX-2GGT进行吸附固载.圆二色光谱分析和活性位点滴定结果表明,固定化前后酶的二级结构和活性位点数变化很小,固定化后GGT对供体的亲和力及转肽反应催化常数均有不同程度下降,但固定化酶对产物的亲和力有明显提高.固定化后GGT的热稳定性和pH稳定性均较游离酶有显著提高,固定化酶稳定性良好,经10批次转化后,固定化催化活性仍保持74%.以固定化GGT为催化剂,在L-谷氨酰胺(L-Gln)5mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-bzl-cys)15mmol/L、酶浓度0.062U/mL和pH9.0条件下,40℃水浴反应5h,产物浓度为1.2mmol/L.     

有序介孔TiO2固载g-谷氨酰转肽酶催化合成S-bzl-g-glutamyl-L-cysteine

以有序介孔TiO2(OM-TiO2)为载体对B. subtilis NX-2 GGT进行吸附固载. 圆二色光谱分析和活性位点滴定结果表明,固定化前后酶的二级结构和活性位点数变化很小,固定化后GGT对供体的亲和力及转肽反应催化常数均有不同程度下降,但固定化酶对产物的亲和力有明显提高. 固定化后GGT的热稳定性和pH稳定性均较游离酶有显著提高,固定化酶稳定性良好,经10批次转化后,固定化催化活性仍保持74%. 以固定化GGT为催化剂,在L-谷氨酰胺(L-Gln) 5 mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-bzl-cys) 15 mmol/L、酶浓度0.062 U/mL和pH 9.0条件下,40℃水浴反应5 h,产物浓度为1.2 mmol/L.     

色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸的研究

利用重组色氨酸合成酶催化合成S-苯基-L-半胱氨酸,考察了反应温度、pH、底物摩尔比和底物浓度对色氨酸合成酶酶活影响。最佳转化条件为：反应温度为37 篊,pH为8,L-丝氨酸与苯硫酚的适宜底物摩尔比为1:1.2,底物最适合浓度为400 mmol/L,反应达到平衡时间为16 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率达到91%,苯硫酚与色氨酸合成酶活性位点Ser 235和Gly 233形成稳定的氢键。     

色氨酸合成酶酶法合成S-苯基-L-半胱氨酸

利用重组色氨酸合成酶催化合成S-苯基-L-半胱氨酸,考察了反应温度、pH、底物摩尔比和底物浓度对色氨酸合成酶酶活的影响。最佳转化条件为:反应温度为37℃,pH=8,苯硫酚与L-丝氨酸的适宜底物摩尔比为1.2∶1,底物最适合浓度为400 mmol/L,反应达到平衡时间为16 h,底物L-丝氨酸摩尔转化率达到91%,苯硫酚与色氨酸合成酶活性位点Ser 235和Gly 233形成稳定的氢键。     

S-苄基-L-半胱氨酸的合成

由溴化苄和L-半胱氨酸直接合成S-苄基-L-半胱氨酸,通过正交试验及统计分析,检验了各影响因子的显著性,确定了最佳工艺条件为：反应时间2.5h,反应温度45℃,原料配比n（溴化苄）：n（L-半胱氨酸）=1：1.在此条件下反应,摩尔产率可达到95%.     

L-谷氨酰肼为底物酶法制备茶氨酸

采用一种廉价的底物L-谷氨酰肼代替L-谷氨酰胺,成功地合成了茶氨酸,并且对该酶促反应的条件进行了初步优化。结果表明,以L-谷氨酰肼为底物时,γ-谷氨酰转肽酶(GGT)活性约是以L-谷氨酰胺为底物时的78.3%。该酶促反应的最适条件为:pH=10,反应温度40℃,n(L-谷氨酰肼)∶n(乙胺)=1∶10,L-谷氨酰肼初始浓度0.3mol/L。利用以上条件进行了茶氨酸的小量制备,投料L-谷氨酰肼50g,乙胺140g,反应40h,L-谷氨酰肼的摩尔转化率达84.1%,经离子交换树脂分离产物,得到31.8g高纯度茶氨酸。该结果显示良好应用前景。     

γ-谷氨酰转肽酶的酶学性质及其转肽反应机制

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)能专一地催化γ-谷氨酰基的转移,在γ-谷氨酰基类衍生物的合成方面具有重要的应用价值.今利用Bacillus subtilis NX-2发酵生产GGT,上清液中的GGT经硫酸铵沉淀后,以DEAE Sepharose FF和 Source 15 Q 两步离子交换进行纯化.以γ-D-Gln-L-Trp(SCV-07)为目的产物,研究了GGT的基本酶学性质,确定了其最适反应温度为40 ℃,最适Ph值10.0, 供体/受体浓度为5:7,最适反应时间为4 h,产物转化率可高达42%.结合反应进程曲线,分析了GGT的作用机制,并通过实验证实了GGT不仅具有转肽活性,还可催化产物的不可逆水解,这是导致产物回收率下降的关键原因.经测定得到GGT的转肽反应米氏常数(Km)为5.08 mmol·L-1,最大反应速率(rmax)为0.034 mmol·(min·L)-1;对γ-D-Gln-L-Trp的水解反应米氏常数(Km')为2.267 mmol·L-1,最大反应速率(rmax')为0.012 mmol·(min·L)-1.     

离子交换法分离S-苄基-g-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

采用离子交换法对酶法合成的S-苄基-g-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)进行了分离纯化. 研究了Q Sephrose FF阴离子交换树脂对S-Bzl-GGC的吸附等温线,很好地符合Sips吸附等温线模型. 考察了pH值、洗脱梯度、流速和进样量等条件对纯化效果的影响,建立了一套基于Q Sephrose FF阴离子交换树脂的纯化方案. 结果表明,在pH 8.2、洗脱梯度0~30% B(Tris-HCl缓冲液+1 mol/L NaCl) 12 mL、流速2 mL/min、进样量500 mL的优化条件下,经一步分离,产物纯度可达98.5%,经1H-NMR鉴定产物结构正确.     

酶法拆分氮-15标记S-苄基-半胱氨酸的研究

S-苄基-半胱氨酸是化学法制备氮-15（^15N）标记胱氨酸及其衍生物的重要前体,以S-苄基-D,L-半胱氨酸为拆分底物,对氨基酰化酶酶促拆分工艺如反应温度、初始pH值、酶和底物的用量、反应时间等工艺参数进行了考察。在较佳的工艺条件下,苄基-L-半胱氨酸拆分的单程收率达到45%,未出现同位素丰S-度稀释现象。     

S-苯基-L-半胱氨酸合成的反应动力学及反应机理的研究

运用过量浓度法和微分法研究合成S-苯基-L-半胱氨酸的反应速率随反应物浓度变化的规律,确定了S-苯基-L-半胱氨酸合成反应的速率常数和反应级数,建立了反应速率方程,同时探讨了反应机理,为进一步优化反应条件提供了理论基础,并且通过实验找到了反应的最佳条件。     

S-甲基-L-半胱氨酸的合成

以 L-半胱氨酸为原料 ,磷酸三甲酯为甲基化试剂合成了 S-甲基 - L-半胱氨酸。研究了 p H值、温度等反应条件对产品品质和收率的影响。发现在严格控制 p H为 7.0 ,反应温度不高于 37°C的条件下 ,并不出现消旋作用。这一合成路线可用于工业上大规模生产     

微生物转化法合成L-半胱氨酸的研究

以DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)为转化底物,采用来自假单胞菌(Pseudomonas sp.)TS1138的L-半胱氨酸合成酶系对DL-ATC进行生物转化合成L-半胱氨酸.对转化条件进行了研究,得出TS1138菌株合成L-半胱氨酸的最适转化条件;反应温度为42～44℃,转化时间为2.5 h,底物质量浓度为6g/L,酶源细胞浓缩倍数为5倍.动力学研究表明,TS1138菌株L-半胱氨酸合成酶系的米氏常数(Km)为7.1 997 mmol/L,最大初反应速度Vmax=41.6629 mmol/(L·min).     

共表达PPK和GMAS全细胞催化合成L-茶氨酸

利用pETDuet-1质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达了多聚磷酸盐激酶(PPK)和γ-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS),并以共表达PPK和GMAS的重组菌全细胞催化合成L-茶氨酸,优化了反应参数。SDS-PAGE结果表明,PPK和GMAS共表达成功;最佳全细胞催化反应条件为:35℃,pH=7.0,谷氨酸钠300mmol/L,乙胺盐酸盐420 mmol/L,六偏磷酸钠100 mmol/L,添加2 mmol/L起始量ATP,在100 mL反应体系中转化24 h,L-茶氨酸浓度达到199 mmol/L,谷氨酸钠的转化率达到66.34%。     

L-半胱氨酸对酪氨酸酶的抑制动力学研究

用酶动力学方法考察了L-半胱氨酸对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性的抑制效应。结果表明,L-半胱氨酸对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用,导致单酚酶活力和二酚酶活力下降50%的L-半胱氨酸浓度(IC50)分别为20.3μmol/L和52.0μmol/L。在降低蘑菇酪氨酸酶酶活的同时,L-半胱氨酸能明显延长单酚酶和二酚酶的延滞时间。探讨了二酚酶延滞时间产生的原因:L-半胱氨酸与酪氨酸酶催化氧化产物多巴醌反应,形成了无色的L-DOPA的L-半胱氨酸衍生物,从而阻断了多巴色素的形成,直至体系中的L-半胱氨酸反应完全后,多巴醌才开始转化为多巴色素。L-半胱氨酸对二酚酶的抑制作用表现为不可逆的竞争性抑制。     

N（2）-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的合成工艺研究

以D-2-氯代丙酰氯和L-谷氨酰胺为原料,缩合得到N-（D-2-氯丙酰）-L-谷氨酰胺,再经氨化后得到N（2）-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。缩合反应使用2倍氢氧化钠水溶液并采用与D-2-氯代丙酰氯同时滴加的方式、在两相的甲苯/水体系中、温度在0～5℃结果最佳,收率92%。氨解反应使用浓氨水、在60℃下结果最佳,收率67.5%。     

酶法制备γ-D-glutamyl-L-tryptophan的动力学模型

以酶法合成γ-D-glutamyl-L-tryptophan (γ-D-Glu-L-Trp)为研究体系,采用D-谷氨酰胺为γ-谷氨酰基供体,L-色氨酸为受体,测定得到了转肽反应的米氏常数（K _m）为5.11 mmol·L^-1,催化常数（K_cat）为3.92 mmol·min^-1,γ-D-Glu-L-Trp的水解反应米氏常数（K′_m）为2.31 mmol·L^-1,催化常数（K′_cat）为1.46 mmol·min^-1。采用顺序反应机制建立了酶法制备γ-D-Glu-L-Trp的过程动力学模型,并进行了参数优化。经验证,所建模型可准确预测该体系中的反应进程,模型数值解与实验值的平均相对误差小于5%。     

L-半胱氨酸盐酸盐合成工艺的优化

建立了邻二氮菲-Fe3+法测定L-半胱氨酸盐酸盐含量的计算模型,吸光度与含量间的关系为y10 842.1x,方差R0.999 0;通过正交试验优化了L-半胱氨酸盐酸盐的合成工艺条件,经SPSS软件统计分析结果表明,L-半胱氨酸盐酸盐合成的优化条件为:反应时间4 h、HCl浓度4 mol/L、反应温度80℃,产品收率高达99.51%,比文献收率提高了9.5%。     

N-乙酰-L-半胱氨酸抗H2O2诱导人体皮肤成纤维细胞损伤的研究

研究了N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对H2O2刺激的人体皮肤成纤维细胞(HSF)的抗细胞损伤作用。细胞存活率和细胞阳性率实验结果表明:NAC在低质量浓度(50~100 mg·L-1)时对HSF没有明显的细胞毒性;在质量浓度为200~800 mg·L-1时可促进细胞增殖;而在质量浓度较高(1 000 mg·L-1)时则明显抑制HSF生长。空白组、H2O2组、H2O2(500μmol·L-1)+NAC(100 mg·L-1)组和H2O2(500μmol·L-1)+NAC(200 mg·L-1)组细胞阳性率分别为39.90%,69.57%,45.29%和36.60%,NAC可明显降低β-半乳糖苷酶染色阳性率,抵抗由H2O2引起的细胞损伤。