3种食源性致病菌多重PCR检测体系的建立

目的:探究用PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella spp.)及志贺氏菌(Shigella spp.)的检测灵敏度,建立快速检测3种食源性致病菌的多重PCR方法。方法:分别依据金黄色葡萄球菌的fem A、沙门氏菌的hil A基因及志贺氏菌的ipa H基因设计3对特异性引物,对3对引物进行多重PCR反应体系构建与优化。结果:建立的多重PCR方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的优点。结论:研究结果为上述3种食源性致病菌快速检测试剂盒的研发及在食品安全检测工作中的应用提供了重要技术保障。     

多重PCR法对乳制品中3种致病菌的同时快速检测

通过调整混合培养基的配比摸索乳制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据三种目标致病菌的保守基因分别设计多重PCR引物,对致病菌进行多重PCR检测.结果表明,方法具有良好的针对目标致病菌的特异性,检测限可达102mL1.且反应体系各组分间未见交叉干扰.对人工污染的乳品盲样检测验证了方法的实用性.     

二重PCR法快速检测3种食源性致病菌

目的建立快速检测食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)及志贺氏菌属(Shigella spp.)的二重PCR方法。方法分别针对金黄色葡萄球菌.femA和nuc、沙门氏菌属invA和hilA及志贺氏菌属ipaB和ipaH设计6对特异性引物,检测每对引物的特异性及灵敏度,组合优化各自二重PCR反应体系。结果初步建立了针对这3类致病菌的二重PCR检测方法,整个检测过程不超过18 h,检测灵敏度均可达10 pg DNA/reaction。结论所建立的针对3类致病菌的二重PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和方便高效等优点,具有良好的市场应用前景。     

PCR法快速检测三种食源性致病菌的研究

目的 探讨用PCR方法快速检测食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和志贺氏菌(Shigella spp.)的实用性。方法 采用能力验证实验和超市样品检测实验对PCR方法与传统检测方法进行比较。结果 与传统检测方法相比, PCR方法检测以上三种食源性致病菌的结果准确率达到99%以上, 假阳性率低于1%, 假阴性率为0。结论 PCR检测方法具有检测周期短等优点, 可以在当前的食品安全检测工作中应用推广。     

靶序列富集多重PCR结合DHPLC同时检测5种食源性致病菌

目的建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌5种食源性致病菌的简便、灵敏的高通量方法。方法根据GenBank公布的5种致病菌的特异性靶基因序列,设计5对特异性引物,与通用引物连接构成复合引物。经过反应条件的优化,建立了5种致病菌的靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)扩增方法,扩增产物采用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术进行检测。结果采用Tem-PCR-DHPLC方法,检测48株试验菌株,未发现非特异性结果。对5种致病菌检测灵敏度,除金黄色葡萄球菌为620 cfu/mL外,其余都小于100 cfu/mL。对4种样品的检测结果与国家标准方法相符合。结论 Tem-PCR-DHPLC检测方法,相比传统多重PCR方法,能有效地解决引物扩增效率不均衡的问题,不需优化引物浓度,方法特异性强,灵敏度高,具有较好的实用性。     

4种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究

为快速检测蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和沙门氏菌4种食源性致病菌,建立4重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的检测方法。针对菌株的特异性基因设计引物,选择退火温度相近,扩增条带区间不同的引物为多重聚合酶链式反应引物组,并对多重PCR的引物浓度、退火温度进行优化,确定扩增条件。结果表明,在54℃的退火温度下,4种菌可扩增长度为246、166、65、107 bp的清晰片段,其检测灵敏度为蜡样芽孢杆菌2×101CFU/mL,金黄色葡萄球菌可达1.3×102 CFU/mL,志贺氏菌可达1.3×102 CFU/mL,沙门氏菌可达1.4×102 CFU/mL。     

三种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的:建立同时快速检测沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法:根据沙门氏菌的invA基因、志贺氏菌的ipaH基因及肠出血性大肠杆菌O157∶H7的uidA基因设计3对引物,通过单因素实验、L9(34)正交实验优化反应体系,并对多重PCR扩增的敏感性进行分析。结果:3对引物能特异性扩增出495、620、252bp的目的片段;在最优多重PCR反应体系下,多重PCR检测3种致病菌的灵敏度达104CFU/mL;将该法应用于人工污染实验,可在5h内得到准确、稳定的检测结果。结论:该方法操作简单、检测特异性和灵敏度较高,能够实现对沙门氏菌、志贺氏菌和肠出血性大肠杆菌O157∶H7 3种食源性致病菌的快速监控和诊断。      

食品中3种致病菌的Taqman多重荧光定量PCR检测

利用实时荧光定量PCR(RTi-PCR)技术探索病原微生物的快速高通量检测方法已是食品微生物学的研究热点之一。首先,通过调整混合培养基的配比摸索食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据3种目标致病菌的保守基因分别设计RTi-PCR引物和双标记Taqman探针,分别使用FAM、TAMRA及CY5作为报告基团,对致病菌进行多重RTi-PCR检测,并设计、构建了阳性内参用于检测反应体系。结果表明,方法针对42种已知目标菌株和21种已知菌株组合特异性良好,检测限可达101 cfu/PCR反应,且反应体系各组分间未见交叉干扰。阳性内参Ct值保持稳定,有效地保证了检测的可靠性。对人工污染的食品盲样检测验证了方法的实用性。总之,建立了一种食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌同时快速检测的多重RTi-PCR方法,为食源性致病菌的检测提供了新的方法学依据。     

环介导等温扩增技术在典型食源性致病菌检测中的应用进展

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种新颖的核酸恒温扩增方法。因其具有简单、快速、特异性强的特点,在国外已经成功应用于多个行业,并在其中发挥着越来越重要的作用。阐述LAMP技术在大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌4种食源性致病菌检测中的最新研究进展,将近年来针对4种细菌建立的LAMP方法中的靶基因、灵敏度和特异性进行汇总比较,对LAMP试验常见问题进行分析,展望其在中国食源性致病菌检测领域的研究和应用发展前景。     

5种食源性致病菌PCR检测方法的建立

目的建立食品中的沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的PCR快速检测方法。方法以缓冲蛋白胨水为增菌培养基,采用直接提取法提取DNA并测定其核酸浓度。对PCR的退火温度、模板浓度进行优化,把5种目标菌分为两组进行检测分析,并进行特异性和灵敏度实验。结果 5种目标菌培养后均表现出良好的生长趋势。PCR扩增最佳退火温度为59℃, 5种目标菌的引物特异性好,方法的检测灵敏度高。沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌最低检出核酸浓度分别为0.0202、0.158、0.187、2.30和1.05μg/mL。结论该方法简便、快速、灵敏度高,能满足食品安全检测要求。     

多重PCR检测婴幼儿配方奶粉中3种食源性致病菌

为建立一种能够同时检测婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重PCR检测方法。通过单重PCR验证了9对引物的特异性,筛选出其中3对特异性好的引物建立了多重PCR体系,对其特异性和灵敏度进行评价,并将其应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测。结果表明,针对克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种食源性致病菌所筛选的3对引物分别能扩增出469、638和796 bp的目的条带,具有高度特异性。多重PCR检测体系的最佳退火温度为55℃,最佳Mg²⁺浓度为2.00 mmol/L,最佳引物浓度为400 nmol/L。在此条件下3种目的菌在10² CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带。将建立的多重PCR检测体系应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测,其检出限达到10³ CFU/g。本研究初步建立了一种能准确、快速、特异性的检测PIF中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,适用于PIF中3种常见的食源性致病菌的快速检测。     

速冻食品中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌多重PCR检测方法的建立与应用

为实现速冻食品中沙门氏菌(Salmonella spp.)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的多重聚合酶链式反应(PCR)检测,首先优化多重PCR扩增的反应条件,比较基因组DNA提取方法,结果表明：退火温度采用60℃、各引物浓度200nmol/L及扩增循环35次,本多重PCR检测技术可以有效地将沙门氏菌和金黄色葡萄球菌同时检出,检测特异性为100%。3种DNA提取方法中试剂盒法纯度最高,检出限分别是31、26DNA copies/reaction。经过在人工污染致病菌的速冻水饺中应用试验后,该多重PCR方法经过4h的增菌培养即可从速冻水饺中同时检测出起始菌落数低至100CFU/g的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

南美白对虾中四种病原菌的多重PCR检测

根据沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白基因(invA)、单增李斯特菌的侵入关联蛋白基因(iap)、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)和副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因(tdh)分别设计4对特异性引物,并以细菌16S rRNA基因的部分保守序列为内标,通过对退火温度、引物浓度等反应参数的调整和优化,建立的多重PCR方法为10×PCR buffer 2.0μL(含Mg2+)、dNTP 200μmol/L、DNA模板1μL、Taq DNA聚合酶2.5U,引物浓度分别为16S rRNA 200nmol/L、tdh 250nmol/L、nuc 300nmol/L、iap 350nmol/L、invA 250nmol/L,加无菌水至总体积为20μL;反应条件：94℃预变性4min、94℃变性30s、57℃退火40s、72℃延伸1min、72℃延伸10min,反应共进行30个循环。为检验该方法的可行性,进一步对人工接种上述4种病原菌的南美白对虾进行多重PCR检测。结果表明：对污染样品直接提取DNA和预增菌后提取DNA再进行多重PCR检测,均能有效扩增出各个目的片段;但预增菌处理后可使检测限明显降低,进而大大提高检测的灵敏度。本多重PCR方法可作为食品包括水产品中病原微生物的快速、灵敏和高效的检测方法。     

食品中3种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

目的:建立同步速测食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法:利用基因组比对法寻找3种致病菌的特异性序列——沙门氏菌的invA基因、金黄色葡萄球菌的nuc基因和单增李斯特菌的prs基因,运用Primer Premier 5.0分别设计3对片段大小不同的特异性引物;通过优化反应体系,建立3种致病菌的多重PCR检测体系。结果:建立的多重PCR方法灵敏度测试结果分别为7.6、3.8、5.1pg/μL,在此灵敏度下可以扩增出全部特异性引物条带,验证性实验结果出现相应的目的条带且未发生交叉影响。结论:初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。     

多重PCR法检测鲜切哈密瓜中3种食源性致病菌

建立可同时检测鲜切哈密瓜中的单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌O157:H7的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。根据单增李斯特菌inl A基因、鼠伤寒沙门氏菌inv A基因、大肠杆菌O157:H7的wzy基因设计3对特异性引物。对多重PCR反应体系中的引物浓度、退火温度、Mg2+浓度、d NTP浓度进行了优化,并确定适宜的多重PCR反应体系及反应条件。结果表明:25μL反应体系,10×PCR buffer为2.5μL,Mg Cl2(25 mmol/L)为3.5μL,d NTPs(2.5 mmol/L)为2μL,inl A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,inv A基因上下游引物(5μmol/L)为1μL,wzy基因上下游引物(5μmol/L)为2μL,单增李斯特菌DNA模板为1μL,鼠伤寒沙门氏菌DNA模板为1μL,大肠杆菌O157:H7 DNA模板为1μL,ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)为0.3μL,加dd H2O补足25μL。反应条件为95℃预变性3 min;94℃变性30 s,53.9℃退火30 s,72℃延伸30 s,32个循环;72℃延伸10 min。鲜切哈密瓜中人工接种的目标菌的灵敏度为单增李斯特菌2.7×104 CFU/g,大肠杆菌O157:H7 3.3×104 CFU/g以及鼠伤寒沙门氏菌3.8×104 CFU/g。该技术可为快速检测鲜切哈密瓜中病原菌污染度及其控制提供参考依据。     

多重荧光定量PCR检测食品污染菌

目的:建立食品中多种细菌同时检测的方法。方法:以肠杆菌科细菌16S RNA、金黄色葡萄球菌FemB基因以及和沙门氏菌的invA基因为目标,设计相应的引物和Taqman探针;分别构建重组质粒作为模板,并建立3种菌属各自荧光定量PCR检测方法和多重荧光PCR体系,考察各方法的灵敏性,并比较多重荧光PCR与单重体系下检测结果的一致性。结果:多重荧光PCR体系与单重体系具有很好的一致性。结论:多重荧光定量PCR能够实现在同一反应体系下同时对食品中多种污染菌进行准确快速的检测。     

食源性致病菌通用型多重荧光PCR快速检测体系的建立

以两种食源性致病菌(沙门氏菌、单增李斯特菌)为模板,对通用型多重荧光PCR快速检测体系进行了研究。建立的通用型多重荧光PCR反应体系为:25μL反应液中,Tris-HCl为50mmol/L、pH值为8.8、KCl15mmol/L、(NH4)2SO4为8mmol/L、Mg2+为3mmol/L、dNTP为1.0mmol/L、引物和探针的终浓度分别为1μmol/L和0.5μmol/L、加入0.5μLDMSO,2.5U/份的Taq酶与等量的Taq酶抗体。