狂犬病病毒抗原ELISA检测方法的建立及其应用

目的建立狂犬病病毒抗原ELISA检测方法,并进行初步应用。方法采用狂犬病病毒CTN-1V纯化抗原免疫家兔,制备多克隆抗体,作为酶标抗体,马抗狂犬血清纯化抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA法。对该方法进行验证,检测狂犬病病毒原液毒力和疫苗效力,并与小鼠(NIH)法检测结果进行对比。结果双抗体夹心ELISA检测方法的最低检出限为0.17 IU/ml,最佳线性范围为0.17～2.00 IU/ml,相关系数R>0.97;批间及试验内变异系数均小于10%,特异性、稳定性均良好;检测20批病毒原液毒力及疫苗效力,结果与NIH法相比,差异无统计学意义。结论已建立狂犬病病毒抗原ELISA检测方法,可用于生产过程中狂犬病疫苗原液和半成品的检定。     

人用狂犬病疫苗免疫抗体检测方法的比较

对人用Vero细胞狂犬疫苗全程免疫后的个体 ,分别在不同时期采血 ,用小鼠中和试验及快速荧光灶抑制试验与不同抗原包被的ELISA法测定结果进行比较 ,显示出用CVS株为包被抗原的ELISA与MNT、RFFIT法检测结果的差异无显著意义 ,优于aG株为包被抗原的ELISA法。     

应用鲎试剂法检测人用纯化狂犬病疫苗的内毒素

<正>为了解人用狂犬病疫苗中内毒素的含量,我们应用鲎试剂法对纯化地鼠肾细胞人用狂犬病疫苗进行了检测,现将结果报道如下。     

冻干人用狂犬病纯化疫苗稳定性观察

目的　考察用Vero细胞微载体技术研制的冻干人用狂犬病纯化疫苗的稳定性。方法　对疫苗在2～ 8℃放置 2 .5～ 4年的外观、溶解时间、水分、溶解后pH和效力进行检测 ,并进行 37℃ 2～ 4周和 4 5℃ 2周的热稳定性试验。结果　各项检测结果均达到 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》的要求。结论　该疫苗质量稳定     

孕妇接种国产Vero细胞人用狂犬病纯化疫苗的安全性

<正> WHO“流行病周报”已明确报道“孕妇暴露后仍可接种狂犬病疫苗”,但我国2000年版《中国生物制品规程》人用狂犬病纯化疫苗使用说明仅规定“由于狂犬病是致死性疾病,疫苗注射无禁忌症”,并未明确孕妇可以注射,至使许多经犬致伤的孕妇是否可以注射疫苗提出疑义。特别是对不同孕期的孕妇暴露后接种国产Vero细胞人用狂犬病纯化疫苗的安全性,尚未见报道。长春长生生物科技股份有限公司生产的     

原代细胞在人用狂犬病疫苗中的应用及研究进展

原代细胞直接来源于动物,保留了其来源组织的特性,不具有致瘤特性.原代细胞仅使用简单的培养基和牛血清即可实现工业化生产,而且通常对多种病毒具有广泛的敏感性.但原代细胞也有不足:操作过程中污染的风险高;不同来源的动物质量不稳定;虽然非人类灵长类动物的细胞培养在过去被广泛使用,但其在某些国家和地区已越来越难以获得,而且有时使...     

狂犬病疫苗纯化工艺的建立

应用柱层析法对地鼠肾细胞狂犬病疫苗进行纯化 ,纯化后病毒收率达 77 4% ,杂蛋白去除率达 99%以上 ,连续生产 3批中试样品 ,所有检测项目全部合格。该纯化工艺重复性好 ,稳定性高 ,是切实可行的有效生产方法。     

人用精制Vero细胞狂犬病疫苗的研制

目的　应用Ｖｅｒｏ细胞研制人用精制狂犬病疫苗。方法应用Ｖｅｒｏ细胞经转瓶或生物反应器培养制备人用精制江大病疫苗。结果各项质控指标均符合ＷＨＯ和中国生物制品规程标准,经Ｉ期临床观察疫苗是安全的。结论用Ｖｅｒｏ细胞生产的狂犬病疫苗产量大,效价高,不良反应少,且能进行工业化生产。     

犬用口服狂犬病疫苗的研究

用我国分离并传代适应的狂犬病病毒固定毒22号毒株作为家犬口服疫苗毒株。22号毒株活毒疫苗用于家犬一次口服(拌入煮熟待凉的粥内,在口腔停留约30秒至2分钟服完)即可获得免疫。免疫力可持续15个月,至少与国外Flury LEP疫苗相同。流行病学观察19,425只家犬证明疫苗安全、有效。犬用口服疫苗在我国属首创,国外仅有用于狐狸的口服疫苗,用于家犬的同类制品未见报道。     

应用40L生物反应器制备人用狂犬病疫苗

目的应用40 L生物反应器大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以PV2061株狂犬病病毒为毒种,Vero细胞为基质,应用CelliGen 510生物反应器(40 L),灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制备人用狂犬病疫苗,并对生产过程中各步骤工艺进行取样检测。结果细胞培养密度达1. 2×10~7个/m L,病毒感染后可连续收获约16 d,病毒收获液最高滴度为7. 4 LgLD50/m L。经纯化,杂蛋白去除率达98%以上,成品宿主细胞DNA含量≤50 pg/剂,效价≥4. 5 IU/剂,每罐产量可达13万剂疫苗。结论 CelliGen 510生物反应器可应用于大规模生产人用狂犬病疫苗,疫苗成品检定符合《中国药典》三部(2015版)相关标准。     

黄芪多糖对人用狂犬病疫苗免疫原性的影响

目的研究黄芪多糖对狂犬病疫苗免疫应答的影响。方法将BALB/c小鼠和昆明小鼠各自随机分为2组,即试验组与对照组,分别于0、7d接种冻干人用狂犬病疫苗(Vero细胞)。对照组疫苗用灭菌注射用水稀释,试验组疫苗用10%黄芪多糖(APS)溶液稀释,每只腹腔免疫0·5ml。BALB/c小鼠于15d无菌取脾,进行淋巴细胞转化实验;昆明小鼠在免疫前和第1针免疫后4、7、14、30、45和60d眶静脉采血,分别进行外周血淋巴细胞CTL试验和小鼠中和抗体水平测定。结果试验组疫苗诱导小鼠产生的中和抗体和细胞免疫水平均高于对照组疫苗,二者差异有显著意义。结论黄芪多糖能提高狂犬病疫苗的免疫原性。     

生物反应器细胞培养制备人用狂犬病疫苗

目的应用生物反应器培养细胞和病毒,大规模生产人用狂犬病疫苗。方法以巴斯德PV2061为毒种,以143代以内Vero细胞为培养基质,应用生物反应器,每升投放25g微载体,灌流式细胞培养,连续收获病毒液,经浓缩、灭活、纯化,制成Vero细胞狂犬病疫苗。结果细胞培养密度达1.2×107～1.5×107个/ml,病毒感染后可连续收获18～22d,病毒最高滴度8.5LogLD50/ml,平均滴度7.6LogLD50/ml。经柱层析纯化,杂蛋白去除率达99.95%以上,总蛋白含量≤80μg/g,DNA含量≤10pg/0.5ml,GP含量3.5～4.5IU/0.5ml,效力≥4.5IU/0.5ml。结论应用生物反应器细胞培养,可以大规模生产优质Vero细胞人用狂犬病疫苗。     

人用Vero细胞狂犬病疫苗的接种反应观察

目的观察人用Vero细胞狂犬病疫苗的接种反应。方法对810名观察对象采用0、3、7、14、28d共接种5针的程序进行暴露后免疫,观察接种疫苗30min内的即时反应,及24h、72h、15d和3个月内的反应。结果810名观察对象接种人用Vero细胞狂犬病疫苗后,均未发生即时反应,局部及全身一般反应发生率分别为1.85%和1.60%。结论接种人用Vero细胞狂犬病疫苗具有良好的安全性。     

阈值法检测人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量

目的建立人用狂犬病疫苗宿主细胞DNA残留量的阈值检测法,并进行验证。方法验证阈值法的线性范围、准确性及精密度。采用阈值法和DNA探针杂交法分别对3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量进行测定,并进行比较。结果 DNA标准品浓度为3～200 pg时,与检测信号(μV/s)呈良好的线性关系,直线回归方程为y=10. 812 x-36. 761,R2=0. 994 5;加入100和25 pg DNA标准品的样品回收率为88%～110%,CV分别为7. 7%和7. 4%;精密度各次检测CV均10%。阈值法检测3批狂犬病疫苗原液样品宿主细胞DNA残留量分别为181. 9、104. 2和64. 6 pg/mL,DNA探针杂交法检测结果分别为约250、约100和100 pg/mL,二者检测结果相符。结论阈值法有望应用于生物制品宿主细胞残留DNA含量的常规检测,且具有良好的准确性及精密度。     

暴露后接种人用纯化狂犬病疫苗（Vero细胞）安全性的Meta分析

目的 对暴露后接种人用纯化狂犬病疫苗(Vero细胞)(purified Vero cell rabies vaccine,PVRV)的安全性进行Meta分析。方法 以狂犬病、疫苗和安全性为关键词,分别于PubMed、EMBASE、Cochrane和中国知网(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)检索文献,并辅以人工检索。根据纳入和排除标准筛选文献并提取数据,应用Review Manager 5.4软件对两种免疫方案(Zagreb和Essen)的不良反应事件发生率进行Meta分析。结果 共纳入12项研究,其中7项为前瞻性研究,5项为回顾性研究。大多数纳入研究的偏倚风险较低。Zagreb方案不良反应事件的发生率显著高于Essen方案[相对危险度(relative risk,RR):1.01,95%CI:0.90～1.14;I²=73.00%,P<0.05],但存在高度异质性差异。Zagreb方案发热、疼痛和硬结事件的发生率显著高于Essen方案(RR分别为1.14、0.92、0.86,95%CI分别为0.82～...     

应用复合纯化介质Capto Core700纯化狂犬病疫苗

目的应用复合凝胶Capto Core700作为纯化介质去除狂犬病疫苗中的Vero细胞宿主蛋白和宿主细胞DNA等杂质。方法将Vero细胞接种至微载体,在celligen plus生物反应器中培养,按MOI=0.002接种狂犬病病毒,连续制备10批狂犬病疫苗原液。经过滤及浓缩后加入β-丙内酯,于2~8℃灭活24 h,获得病毒灭活液。上样至装载复合凝胶Capto Core700的纯化柱进行层析纯化,并按《中国药典》三部(2015版)的方法检测宿主细胞蛋白去除率、宿主细胞DNA去除率、狂犬病病毒糖蛋白回收率及总蛋白去除率。同时与传统Sepharose系列凝胶纯化方法进行比较。结果 10批疫苗纯化液的宿主细胞蛋白去除率为58.3%~63.2%,宿主细胞DNA去除率均90%,糖蛋白回收率范围为52.3%~74.5%,蛋白去除率范围为7.22%~11.76%。与传统Sepharose系列凝胶纯化方法比较,差异较小,且Capto Core700的上样量为3倍柱体积,高于Sepharose凝胶(15%)。结论 Capto Core700凝胶可有效去除狂犬病疫苗中的杂质,缩短了纯化工艺时间。     

我国狂犬病疫苗的现状及出路

1885年法国微生物学家巴斯德首次将狂犬病家兔脊髓液用于人体并获得成功，开创了用疫苗预防和治疗狂犬病的先河。随着现代细胞培养技术和分子生物学的发展，使狂犬病疫苗得到进一步的完善。一、国外狂犬病疫苗研究及应用现状二倍体细胞狂犬病疫苗。人二倍体细胞建株于人胚肺细胞，它可连续传40～60代而不改变其染色体数，保持二倍体，不发生突变、建立细胞种子库后，可以大量扩增。用于疫苗的工业化生产。美国于1980年批准使用人二倍体细胞疫苗，每年有2～2．5万人接受暴露后预防，至今已应用100多万人份，无1例失败，但由于这种疫苗生产周…     

人用冻干无佐剂狂犬病疫苗的临床观察

目的观察人用冻干无佐剂狂犬病疫苗(武生欣宁)接种人体后的临床反应和免疫效果。方法40名健康者分别于0、3、7、14和28d接种疫苗,观察接种者副反应,并于接种后采血,用快速荧光灶抑制试验检测血清中和抗体水平。结果第1针和第2针接种后副反应率分别为2.5%和7.9%,后3针副反应率为0。免疫前抗体均为阴性,接种后第7天抗体阳转率为76%,第14天抗体水平GMT为9.42IU/ml,阳转率100%,第28天抗体水平GMT为9.83IU/ml,阳转率100%。结论人用冻干无佐剂狂犬病疫苗反应轻微,效果良好。     

接种人用狂犬病疫苗后的抗体水平分析

599例犬咬伤患者常规接种狂犬病疫苗后，用ELISA方法检测抗体阳性515人，阳性率为85．98％，未检出抗体84人，其中69人又加强接种2针疫苗，有57人抗体阳转，阳转率为82．60％。在抗体阳性的515人中，不同性别间的抗体水平无显著差异，但20岁以下年龄组抗体阳性率高于21岁以上年龄组（P＜0．01）。     

兽用灭活纯化狂犬病疫苗生产工艺的优化

目的优化兽用灭活纯化狂犬病疫苗的生产工艺。方法建立BHK21C13细胞主细胞库、工作细胞库,狂犬病病毒疫苗株LEP-Flury主种子批、工作种子批,并进行鉴定。优化悬浮培养工艺参数,并分析病毒原液浓缩、纯化和灭活过程中抗原及成品的稳定性。结果主细胞库、工作细胞库无外源因子污染,细胞形态、生长良好;狂犬病病毒主种子批和工作种子批无外源因子污染,病毒滴度最高可达107.8logLD50/ml。采用15L生物反应器,在优化的培养工艺条件下,细胞密度可达4.5×106个/ml,病毒按0.3MOI接种,灌流培养5次,病毒滴度平均可达106.8logLD50/ml。病毒原液合并后,经750KD中空纤维柱30倍浓缩,Sepharose Fast Flow6层析柱纯化,1/4000β-丙内酯灭活,期间加入稳定剂,纯化疫苗效价平均达(5.03±1.84)IU/头份,纯化的抗原量达(11.75±0.70)μg/头份,在4℃可保存24个月,在37℃可保存30d,在45℃可保存12h。结论优化的兽用灭活狂犬病疫苗的生产工艺可提高疫苗的安全性、有效性及稳定性。