重组人干扰素βSer~(17)的制备及其对SARS病毒的抑制作用

目的制备重组人干扰素-βSer17(rhIFN-βSer17),并检测其对SARS病毒的抑制作用。方法通过发酵收集菌体,经高压匀浆破碎收集包涵体、有机溶剂抽提、酸沉淀、柱层析纯化重组蛋白,通过细胞病变抑制法检测其对SARS病毒的抑制作用。结果研制的rhIFN-βSer17的纯度超过95%,比活性超过2.0×107IU/mg蛋白,在体外对SARS病毒具有明显的抑制作用。结论已成功制备rhIFN-βSer17,并在体外对SARS病毒具有抑制作用。     

重组人干扰素β1b活性测定国家标准品的研制

目的研制重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)生物学活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhIFNβ1b标准品原液各项质量指标,以rhIFNβ1b国际标准品为标准进行协作标定,并检测其稳定性。结果rhIFNβ1b国家标准品经检测,外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%,分装精度为0.44%。该标准品经3家实验室协作标定24次,几何平均生物学活性为7.18×104IU/支,平均生物学活性的95%可信区间为6.87×104～7.52×104IU/支,单次测定的95%参考值范围为5.76×104～8.68×104IU/支,平均可信限率为4.36%。在温度为-20、4、25和37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论该批rhIFNβ1b活性测定国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,生物学活性定为7.2×104IU/支,批号为08/01。     

重组人干扰素-β(rhIFN-β)中试工艺研究

目的　建立适合大规模生产重组人干扰素 β(rhIFN β)的分离纯化工艺。 方法　采用超声破菌、离心分离包涵体、仲丁醇萃取、Sephacryl 10 0、HIC层析等分离纯化步骤。结果　纯化的rhIFN β纯度达 98%以上 ,比活性为 2 .0× 10 7IU/mg,各项质量指标均符合质控标准。结论　此纯化工艺简便 ,可重复性好 ,适于大规模生产。     

重组人干扰素βSer17的制备及其对SARS病毒的抑制作用

目的制备重组人干扰素-βSer17(rhIFN-βSer17),并检测其对SARS病毒的抑制作用.方法通过发酵收集菌体,经高压匀浆破碎收集包涵体、有机溶剂抽提、酸沉淀、柱层析纯化重组蛋白,通过细胞病变抑制法检测其对SARS病毒的抑制作用.结果研制的rhIFN-βSer17的纯度超过95%,比活性超过2.0×107 IU/mg蛋白,在体外对SARS病毒具有明显的抑制作用.结论已成功制备rhIFN-β Ser17,并在体外对SARS病毒具有抑制作用.     

重组人干扰素β1a生物学活性MTS/PMS检测方法的建立

目的建立重组人干扰素β1a(Recombimant human interferon beta1a,rhIFNβ1a)生物学活性MTS/PMS检测方法。方法将MTS和PMS偶联作为染色液,建立IFNβ1a生物学活性检测方法,对细胞浓度、细胞病变时间、MTS工作浓度和染色时间进行优化,并绘制效应曲线。对建立的方法进行重复性、准确性验证,并与结晶紫染色法进行比较。结果优化后的MTS/PMS法的最佳反应条件为:细胞浓度1×105个/ml,细胞病变时间24～36 h,MTS工作浓度2 mg/ml,染色时间40 min;A570/630值与IFNβ1a保护Wish细胞S型效应曲线的相关系数(R2)均达0.99以上。不同检测板、相同加样位置的变异系数在6%～20%之间;相同检测板、不同加样位置的变异系数在13%～17%之间;检测IFNβ1a细胞收集液的回收率在86%～121%之间。该法检测rhIFNβ1a生物学活性效应曲线呈反"S"型,线型较好,R2值均在0.99以上,均比结晶紫染色法的R2值高,且比结晶紫染色法更稳定。结论已建立了rhIFNβ1a生物学活性MTS/PMS检测方法,适用于常规定量测定rhIFNβ1a的生物学活性。     

重组干扰素a_(1b)的抗病毒活性及其临床作用

目的　了解重组干扰素ａ１ｂ的抗病毒活性及其临床效果。方法应用小牛肾传代细胞（ＭＤＢＫ）与 人羊膜传代细胞（ＷＩＳＨ）测定重组干扰素ａ１ｂ的抗病毒活性;应用４０ｕｇ的剂量连续注射３个月观察治疗乙型肝炎的 临床效果。结果在ＭＤＢＫ细胞中测定的活性比在ＷＩＳＨ细胞中高１１．３倍;４０ｕｇ／ｄ重组干扰ａ１ｂ。治疗乙型肝炎有 效,不良反应轻微。结论　建议以重量（ｕｇ）表示重组干扰素的剂量。     

重组人干扰素的研究进展

重组人干扰素(Recombinant human interferon,rhuIFN)是一类抗病毒、抗肿瘤和多发性硬化调节免疫的重要生物制品。自1957年发现干扰素以来,人们不断采用新技术对干扰素分子结构进行改造,先后研发了原型干扰素、保守干扰素、聚乙二醇修饰干扰素等几十个品种,目前已批准十余个一类新药干扰素上市。本文在回顾干扰素药物历史的基础上,对化学修饰改型干扰素、融合干扰素、杂合干扰素等的研究进展作一综述。     

重组人干扰素β1a的纯化及其理化性质

目的纯化重组人干扰素β1a(recombinant human interferonβ1a,rhIFNβ1a),并分析其理化性质。方法应用15 L生物反应器悬浮微载体培养表达rhIFNβ1a的重组CHO细胞,细胞培养收获液经超滤浓缩、蓝胶亲和层析、脱盐和CM离子交换层析纯化后,采用水泡性口炎病毒抑制法测定rhIFNβ1a的效价;Lowry法测定蛋白含量;等电聚焦电泳法测定其等电点;SDS-PAGE和高效液相色谱法测定其纯度;Western blot法分析其免疫活性;SDS-PAGE和质谱仪测定其相对分子质量;圆二色谱法分析其二级结构。结果共纯化了3批样品,纯化的rhIFNβ1a平均蛋白浓度为0.284 0 mg/ml,平均比活可达1.06×108IU/mg,纯度达95%以上,蛋白质平均回收率为58.36%,蛋白质相对分子质量为20 445.0,等电点约为6.6,免疫活性良好,二级结构与国家标准品基本一致。结论成功纯化了rhIFNβ1a,并检测了其理化性质,为建立大规模制备rhIFNβ1a的生产工艺和制造检定规程,实现产业化奠定了基础。     

注射用重组人干扰素β1b规模化分离纯化工艺的建立及其产品质量的检定

目的建立注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)规模化纯化工艺,并对该工艺制备产品的质量进行检定。方法采用高压均质机对rh IFNβ1b/BL21菌体进行破碎,离心提取包涵体,经有机抽提及酸化沉淀获得粗制rhIFNβ1b;通过Sephacryl S-200和Sephadex G-25层析纯化获得rhIFNβ1b原液,连续生产3批。将原液稀释,加入保护剂,经分装、冻干制备成品。同时对原液及成品的质量进行检定。结果 3批rhIFNβ1b原液蛋白产量可达6~7 g,平均回收率可达15.1%,平均效价为1.1×10~7 IU/mg,HPLC纯度和SDS-PAGE纯度均超过97%,一级序列和二级结构具有良好的一致性。每批rhIFNβ1b原液可制备出20 000~30 000支成品,且各项检定项目均合格。结论建立了rhIFNβ1b规模化分离纯化工艺,制品的产量、纯度及活性均较高,符合rhIFNβ1b工业化生产的要求。     

重组人干扰素β1b治疗复发缓解型多发性硬化症的安全性及临床疗效

目的观察重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)治疗复发缓解型多发性硬化症(RRMS)的安全性及临床疗效。方法选择20名健康志愿者,分为1.5、3、6和9MIU4个剂量组,每天按剂量皮下注射1次rhIFNβ1b,连续注射8d,观察药物的安全性、耐受性和药代动力学。选择101例RRMS患者,随机分为观察组(52例)和对照组(49例),每周3次分别注射6MIU的rhIFNβ1b和25mg人血白蛋白,用药1年后,2组均注射6MIU的rhIFNβ1b,每周3次,用药1年。定期随访并进行各项指标及核磁共振成像(MRI)检查,观察药物的临床疗效,同时进一步观察安全性。结果安全性观察显示,rhIFNβ1b在9MIU剂量范围内耐受性良好。观察组和对照组分别注射rhIFNβ1b后,可显著减少RRMS患者头部与脊髓中病灶数量或缩小病灶体积,并显著降低复发率,且随着用药时间的延长,效果更加明显。结论rhIFNβ1b安全性和耐受性良好,临床影象学评价疗效显著。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素ω的过程优化

采用分子量20000直链单甲氧基PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(mPEG-SS)对毕赤酵母表达的重组人干扰素ω(rhIFNω)进行氨基化学修饰,以期获得抗原性降低及稳定性增加的单链PEG修饰产物(PEG-rhIFNω).建立了PEG修饰rhIFNω的反应体系,考察了修饰反应各因素对单修饰产物得率的影响,优化修饰工艺条件为:...     

重组人促红素体内、体外生物学活性差异成因分析

目的分析造成重组人促红素(rHuEPO)体内、体外生物学活性差异的原因。方法按《中国药典》三部(2005版)方法检测rHuEPO样品体内、体外生物学活性,并通过等电聚焦电泳分析、唾液酸含量、纯度、N-糖链糖基化和相对分子质量检测,探讨样品体内、体外生物学活性产生差异的原因。结果体内、体外生物学活性有差异的rHuEPO样品中,存在糖链末端N-乙酰神经氨酸残基不完整的rHuEPO成分。纯度、N-糖链糖基化和相对分子质量检测结果未见异常。结论为提高rHuEPO产品质量,应在生产过程中有效去除N-乙酰神经氨酸残基不完整的rHuEPO。     

重组人uPA_(17)-KPI大规模发酵及纯化工艺的建立

目的建立重组人uPA17-KPI(rhuPA17-KPI)毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺。方法对工程菌表达rhuPA17-KPI的pH值进行优化。在摇瓶中制备rhuPA17-KPI工程菌种子2L,接种至80L发酵罐中,采用优化的pH值,补料分批培养方式对工程菌进行高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,经甲醇诱导48h后结束发酵。将发酵液离心,经SP Sepharose XL阳离子交换层析和SourceTM 30 RPC反相疏水柱层析纯化。结果建立的发酵工艺为:控制发酵温度为28℃,pH值为5.5,溶氧值为25%～30%之间,在酵母细胞湿重达到190g/L时开始甲醇诱导表达,诱导30h,rhuPA17-KPI的分泌达高峰,为300mg/L发酵液。发酵上清经阳离子交换层析和反相疏水层析纯化后,获得纯度为95%以上的rhuPA17-KPI,产量为180mg/L,回收率为60%。结论已建立了rhuPA17-KPI毕赤酵母工程菌在80L发酵罐中的大规模发酵及纯化工艺,为其产业化及临床应用奠定了基础。     

重组人纽兰格林生物学活性检测方法及质控标准

目的　研究重组人纽兰格林生物学活性检测方法 ,并制定其质量控制标准。方法　采用激酶受体活化的酶联免疫吸附试验 (KIRA ELISA) ,通过优化细胞浓度、样品稀释梯度、药物刺激时间及细胞裂解方法等建立定量测定重组人纽兰格林体外生物学活性的方法 ,同时建立了一套完整可行的质量控制标准。结果　重组人纽兰格林刺激MCF 7细胞表面ErbB2 ErbB3分子磷酸化的反应存在量 效关系 ,相关系数大于 0 98,原液的平均比活性为 85 10U mg± 115 0U mg。并对原液设立肽图、纯度等检测项目 ,对成品设立热原质试验、鉴别试验等检测项目。结论　KIRA ELISA可用于定量检测重组人纽兰格林的体外生物学活性 ,结果准确可靠 ,重复性好 ;建立的方法和标准可以有效控制重组人纽兰格林制品的质量。     

首批重组人干扰素α2b活性测定国家标准品的研制

目的研制首批重组人干扰素α2b(rhIFNα2b)活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2010版)相关要求,进行rhIFNα2b活性测定标准品的制备、检验,以rhIFNα2b国际标准品为标准进行协作标定,并使用热加速试验进行稳定性考察。结果制备的rhIFNα2b活性测定标准品外观、无菌检查合格,水分含量为0.6%,分装精度为0.3%;经5个实验室协作标定共25次,几何平均生物学活性为4.27×105 IU/支,平均生物学活性的95%置信区间为4.13×105~4.42×105 IU/支,单次测定的95%参考值范围为3.65×105~5.00×105 IU/支,平均可信限率为3.32%;在-20℃下,生物学活性降低10%需19.6年,稳定性较高。结论该批rhIFNα2b活性测定标准品各项指标均符合《中国药典》三部(2010版)相关要求,已被批准为国家标准品,规格为:4.27×105 IU/支。     

重组人γ-型干扰素单克隆抗体的鉴定

5株小鼠杂交瘤细胞ID5、1C10、1C11、3H9和6F8，所分泌抗重组人γ－型干扰素（rIFN－γ）单克隆抗体经双扩散试验证明其中4种为小鼠IgG1型，另一种为IgG2b型。用ELISA间接法测定小鼠腹水抗体效价为1：8000～1：128000。经免疫印迹试验证实5种单抗均能特异地识别rIFN－γ，其中1D5、3H9和1C11单抗对rIFN－γ具有中和活性，中和效价＞1：8000，用2种单抗建立的ELISA夹心法检测rIFN－γ，最低可测值为10．0ng／ml，且与白细胞介素－2，重组人α和β干扰素无交叉反应。     

重组干扰素α1b的抗病毒活性及其临床作用

目的 了解重组干扰素α１ｂ的抗病毒活性及其临床效果。方法 应用小牛肾传代细胞（ＭＤＢＫ）与人羊膜传代细胞（ＷＩＳＨ）测定重组干扰素α１ｂ的抗病毒活性;应用４０μｇ的剂量连续注射３个月观察治疗乙型肝炎的临床效果。结果 在ＭＤＢＫ细胞中测定的活性比在ＷＩＳＨ细胞中高１１．３倍,４０μｇ／ｄ重组干扰素α１ｂ治疗惭型肝炎有效,不良反应轻微。结论 建议以重量（μｇ）表示重组干扰素的剂量。     

重组人白介素-12生物学活性检测方法的建立

目的建立重组人白介素-12(rhIL-12)的生物学活性检测方法。方法采用重组人白介素-12刺激外周血淋巴细胞分泌IFN-γ,并用国际标准品校正,进行生物学活性检测。结果用该方法对重组人白介素-12成品及原液进行检测,成品比活性平均值为1037460IU/mg,变异系数为26·0%(n=5);原液比活性平均值为1262270IU/mg,变异系数为16·8%(n=5)。结论该方法检测结果准确、客观,重复性好,可用于重组人白介素-12生物学活性的常规检测。     

重组人干扰素α_(2a)软膏剂的检定及其临床疗效观察

目的　对重组人干扰素α2a软膏的质量进行检定及临床疗效观察。方法　连续试制 3批样品进行稳定性试验及生殖器疱疹的临床疗效观察。结果　本品性质稳定 ,2～ 10℃保存 18个月生物学活性无明显下降 ,其他各项检定指标均符合质量要求。生殖器疱疹的临床疗效观察 ,治疗组有效率为 85 .72 % ,对照组的有效率为 6 5 .2 7% ,差异有显著意义。结论　该制品生产工艺稳定 ,疗效确切 ,安全性好     

重组人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达及生物学活性分析

目的在大肠杆菌中表达重组人白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10),并检测其生物学活性。方法将IL-10基因重组到质粒pET11c中,转化BL21(DE),提取质粒,经酶切鉴定和测序分析;在25℃用低浓度的IPTG诱导表达,对包涵体IL-10稀释复性;经ELISA检测其含量,MC/9细胞增殖法检测其生物学活性。结果工程菌IL-10/pET11c/BL21诱导表达的目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,Westernblot鉴定证实为IL-10蛋白,两种形式的IL-10均具有一定的生物学活性。结论已成功地在大肠杆菌中表达了IL-10,为进一步纯化和制备IL-10的基因工程药物打下了基础。