内切葡聚糖酶基因cel7b 在里氏木霉中的同源表达

用里氏木霉（Trichoderma reesei ）作为宿主同源表达内切葡聚糖酶基因。运用聚合酶链反应（PCR）技术从里氏木霉cDNA中扩增得到内切葡聚糖酶基因cel7b序列,并将其连接到载体p18-m2上构建重组质粒,将重组质粒转化到里氏木霉菌株中,通过筛选获得表达内切葡聚糖酶的重组里氏木霉工程菌。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测显示,发酵液中重组内切葡聚糖酶的分子质量约48 ku。摇瓶发酵结果显示,内切葡聚糖酶在重组里氏木霉中得到分泌表达,发酵液中的内切葡聚糖酶和滤纸酶活分别达到了726 U/mL和28.7 U/mL,分别为出发菌株酶活的2.9倍和1.1倍。玉米芯进行糖化试验结果显示,重组里氏木霉所产酶液糖化玉米芯的酶解得率为81.4%,比出发菌株提高了6.3%。     

利用RNAi抑制cre1基因转录提高里氏木霉表达纤维素酶

本研究采用RNA干扰技术(RNAi)对里氏木霉主要的转录抑制因子cre1基因的表达进行抑制,以期提高里氏木霉生产纤维素酶的能力。通过PCR,从里氏木霉的基因组中扩增得到cbh1启动子、反向的cre1基因片段(568~963 bp)、正向的cre1基因片段(655~961 bp)和cbh2终止子,利用DNA assembler方法将这些基因连接到pRS424质粒上,构建成p Cre1-i质粒。再将RNAi盒分作两个片段扩增,同时转化里氏木霉并通过PCR鉴定阳性转化子。摇瓶发酵显示其中一株转化子在纤维素诱导培养基中培养4.5 d后,其纤维素酶的滤纸酶活、内切葡聚糖酶活和CBHI酶活为0.67、3.70和0.46 U/m L,较出发菌株分别提高了1.3、1.8和5.6倍。通过实时荧光RT-PCR检测,发现该转化子中cre1基因的转录水平比出发菌株降低了43%。     

利用造纸污泥产纤维素酶及产酶条件的优化

以预处理后的造纸污泥为研究对象,检测污泥的组分,利用预处理后造纸污泥,培养里氏木霉生产纤维素酶。研究了碳源浓度、通气量、pH值、摇床转速、温度对里氏木霉产酶的影响,优化产酶条件。结果表明,里氏木霉在优化后的产酶条件下,即碳源浓度40g/L、通气量120L/天、pH值4~6、摇床转速180 r/min、第一天30℃、第二天开始28℃培养时间7天,发酵培养所得粗酶液中纤维素酶和木聚糖酶酶活较优化前的有明显的提高。优化后的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶酶活、木聚糖酶酶活分别为87.53U/m L、121.66U/m L、202.45U/m L。     

一种耐酸热普鲁兰酶生产菌种的分子构建及发酵研究

将长野芽胞杆菌的普鲁兰酶基因经密码子优化后,组建了人工合成的二联启动子Pga2,并将它克隆到枯草芽胞杆菌穿梭质粒p MK4-BPB以及自杀质粒p GE-BPB中;经转化和筛选获得了中性蛋白酶基因npr E被敲除的普鲁兰酶生产菌株CH-1;该重组菌在基础培养基中所产普鲁兰酶的酶活达到30.3 U/m L;经过对培养基组分及发酵条件(培养温度、起始p H,起始接种量等)进行优化,确定了发酵的最适碳源为45 g/L的蔗糖,氮源为60 g/L的麸皮+豆粕时,设定初始培养基的p H为6.2,在培养温度为32℃时进行发酵,CH-1发酵产重组普鲁兰酶酶活高达268 U/m L。     

复合菌系的构建及其对玉米秸秆预处理的研究

本文研究了芽孢杆菌T_(7.0)、黑曲霉Z_3~4和里氏木霉三株菌的产酶情况,并将其进行复合发酵,研究了复合菌的接种顺序、接种比例对酶活力的影响。以葡聚糖内切酶的活力(CMC酶活)和滤纸酶活力(FPA酶活)作为指标,利用解脂假丝酵母预处理玉米秸秆,对预处理秸秆的条件进行了优化。结果表明:复合菌的接种顺序为:同时接种黑曲霉Z_3~4与里氏木霉,12 h后再接种芽孢杆菌T_(7.0);接种比例是:黑曲霉Z_3~4:里氏木霉:芽孢杆菌T_(7.0)为2∶1∶2。解脂假丝酵母预处理秸秆的最优条件是:处理时间36 h、接种量2%、秸秆粉碎度30目。经过生物法对秸秆预处理以后,CMC酶活达到404.28 U/m L。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在酿酒酵母中的表达研究

将PCR合成的瑞氏木霉 (Trichodermareesei) β 内切葡聚糖酶I(EGI)cDNA基因片断分别插入酵母met1 0和 pgk1启动子和终止子序列之间 ,构建了在不同启动子控制下 ,具有不同拷贝数的eg1表达分泌质粒pRS41 5ME、pRS41 5PE和 pRS42 5PE。通过电转化使重组质粒转移至实验室酿酒酵母H1 5 8菌株中 ,分别得到了 3株酵母转化子H1 p、H2p和H1m。在 3株酵母转化子中 ,重组 β 内切葡聚糖酶I都能在酶自身信号肽序列引导下进行分泌型表达。在YPD培养基中 3株重组酵母生长速率大致相同 ,H1m ,H1 p与H2 p的内切葡聚糖酶活力分别为 70 .4,1 2 6.7和 1 2 5 .0U/mL。     

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

基因组重排技术选育纤维素酶高产菌株

利用基因组重排技术对产纤维素酶菌株里氏木霉T306进行育种研究,考察原生质体制备、再生及融合条件的影响因素。研究表明,里氏木霉原生质体制备和再生的最佳条件是:3.5%溶壁酶,菌丝菌龄22 h,酶解时间4 h,酶解温度30℃,采用pH 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,以高渗筛选培养基为再生培养基,再生培养基中渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl。在此条件下,里氏木霉原生质体量达1.44×10~7个/m L,再生率为2.64%。融合试验结果表明,将紫外照射90 s和微波辐射200 s两种方式灭活的原生质体融合,在30%PEG、30 mmol/L Ca~(2+)、30℃条件下处理12 min,原生质体融合率达0.5%。经两轮基因组重排试验,获得一株遗传稳定,产酶能力较强的融合子G2-0832,其内切葡聚糖酶活力达86.40 U/m L,较出发菌株提高了57.08%。     

康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在大肠杆菌中的表达

将康氏木霉(Trichoderma koningii)总RNA反转录成cDNA第一链,并以之为模板进行RT-PCR,合成约1.5kb的纤维二糖水解酶Ⅰ(cbh I)基因.cbhI基因经测序确认后克降到表达载体pET-30a(+)上,PCR和双酶切鉴定筛选阳性重组子;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,并用0.4mmol/L的IPTG诱导表达重组蛋白.实验结果:cbhI基因在BL21(DE3)plysS中胞内融合表达,重组蛋白pNPC酶活为15.6U/L,最适反应温度为45℃,最适pH值为5.0,Mn2+对酶活力有明显的促进作用,SDS-PAGE表明重组蛋白分子量约为70kDa.     

绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的克隆及其在粟酒裂殖酵母中的表达

采用粟酒裂殖酵母诱导表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。通过PCR方法从绿色木霉基因组DNA中克隆到长度为1611bp并含有信号肽序列的cbhⅡ基因;将其插入到粟酒裂殖酵母诱导型表达载体pESP-2的Pnmt1启动子下游,得到重组质粒pESP-2-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞中,通过对酵母转化子质粒DNA的PCR和双酶切鉴定,得到了含有cbhⅡ基因的酵母转化子,对转化子进行诱导培养后提取酵母总蛋白,进行SDS-PAGE电泳检测,得到一条约为81kD的目的蛋白条带;利用DNS法对酵母转化子上清液中的纤维二糖水解酶活性进行测定,结果表明,酶活力最大值为165U/mL。以上结果证明:cbhⅡ基因在Pnmt1启动子控制下在粟酒裂殖酵母中成功地获得表达,并且cbhⅡ自身的信号肽可以被粟酒裂殖酵母正确的识别,并将表达产物分泌至胞外。