重组大肠杆菌发酵生产肝素酶的关键介质组分优化

目的:利用响应面法优化重组大肠杆菌发酵生产肝素酶培养基的关键介质成分。方法:通过PlackettBurman设计对影响肝素酶产量的相关因素进行评价和筛选,选出影响其产量的主要关键因子,然后采用响应面分析法确定这些关键因子的最佳水平。结果:筛选出的具有显著效应的因子为蛋白胨、酵母粉和葡萄糖,当3个因素的质量浓度分别为7.4,11.95 g/L和2.74 g/L时,理论预测的肝素酶活力的最大值为181.49 U/L。3次验证试验获得的肝素酶活力的平均值为177.34 U/L,与理论预测值接近,肝素酶的活力比未优化前提高了1.95倍。结论:本研究结果为肝素酶的产业化应用奠定了良好基础。     

重组大肠杆菌生产海藻糖合酶发酵工艺优化

为了实现来源于嗜热栖热菌的海藻糖合酶的高效表达,对E.coli BL21(DE3)/p ET24a(+)-Tre S基因工程菌在3 L发酵罐进行了发酵工艺优化,获得的最优发酵条件为:诱导温度32℃,当OD600达到50时以0.2 g/(L·h)的速率补加乳糖进行诱导产酶,在该条件下发酵35 h时酶活达到472 U/m L,是优化前的2.3倍;进而采用该条件在30 L发酵罐进行了初步放大研究,酶活达到356 U/m L。由于该海藻糖合酶热稳定性好,因此尝试了高温处理破碎E.coli细胞以释放海藻糖合酶,结果表明,80℃处理30 min,海藻糖合酶的得率可达72.3%,具有工业化应用前景。     

重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化

Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量,以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生Taq DNA聚合酶含量的单因素：发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量,结果表明：发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度,对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响,而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺,响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为：IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值,最佳发酵工艺参数为：发酵温度37.2℃,pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L,在此条件下发酵,Taq DNA聚合酶比活力达到（43.822±0.878）kU/mg。     

重组大肠杆菌产普鲁兰酶发酵条件优化

在7L发酵罐规模,利用自诱导培养方式,对重组大肠杆菌产普鲁兰酶发酵条件进行优化研究,主要考察了发酵过程中控制溶解氧浓度、p H和采用补料策略对菌体生长和普鲁兰酶表达的影响。结果表明,最佳发酵培养条件:溶氧浓度维持在20%~30%;p H保持在7.60;第9 h时,以0.8 g/(L·h)的速度流加甘油;在20 h,以0.2 g/(L·h)的速度流加乳糖。此条件下,重组菌的细胞浓度OD600 nm从12.58上升到42.25,提高了3.36倍;普鲁兰酶酶活力从356 U/ml上升到1 200 U/ml,提高了3.37倍。     

重组大肠杆菌产卤代烷脱卤酶的发酵条件优化

对产卤代烷脱卤酶的重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-DhaA进行发酵优化以提高其表达量。该研究从TB培养基出发,通过单因素实验与响应面实验在摇瓶水平上对培养基各成分进行优化;其次,在最优培养基的基础上对发酵的工艺条件进行优化;最后,在5 L发酵罐中进行了初步放大验证。结果表明,最优的培养基组成为：甘油10 g/L,酵母粉23 g/L,蛋白胨14 g/L,MgSO₄·7H₂O 1.3 g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.1 g/L,酶活力可达到（1 182.94±10.86） U/L,较初始培养基提高了94%;最优的发酵工艺条件为：接种量5%,装液量40 mL/250 mL,37℃培养至OD₆₀₀为1.8时加入终浓度为0.4 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷于20℃诱导22 h,酶活力可达到（3 585.83±15.02） U/L,提高至未进行优化前的5.87倍;5 L发酵罐初步放大验证实验中,酶活力最高达到（9 682.62±191.16） U/L,提高至摇...     

重组大肠杆菌生产核苷磷酸转移酶的发酵条件优化

核苷磷酸转移酶能够特异地将无机焦磷酸(PPi)的磷酸根转移到核苷5'-位的羟基上,该过程并不需要ATP的参与,且具有选择性高和反应条件温和等特点.以实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)/pET28b-AP/PT为菌株,进行了5L发酵罐中的培养条件优化,确定了以乳糖作为诱导剂时,最佳诱导时机OD600为7左右,诱导剂乳糖的浓度为10 g/L;确定了最适通气量为1.5 L/min.在该条件下,核苷磷酸转移酶酶活达221.4 U/L,OD600为20.4.     

重组大肠杆菌发酵生产树莓酮

树莓酮是一种在工业上有多种用途的重要香料物质。将来源于不同植物的4-香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate:Co A ligase,4CL1)、苄基丙酮合酶(benzalacetone synthase,BAS)和苄基丙酮还原酶(raspberry ketone/zingerone synthase,RZS1)基因分别克隆到载体p CDF-DUET-1和p ET-DUET-1中,构建重组质粒并转入大肠杆菌W3110(DE3)中,成功获得了以对香豆酸为前体发酵生产覆盆子酮的重组菌株WCC-1。该菌摇瓶发酵培养2 h后,添加0. 8 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG),30℃诱导,发酵72 h条件下,产覆盆子酮的质量浓度达到125. 86 mg/L;在3 L发酵罐中进行补料分批发酵68 h,覆盆子酮的质量浓度提高到178. 13 mg/L。该研究展现了微生物发酵生产树莓酮的前景。     

响应面法优化重组大肠杆菌产ADI酶发酵培养基

在单因素优化的基础上,采用响应面分析方法对重组大肠杆菌生产精氨酸脱亚胺酶(ADI)的发酵培养基进行了优化。借助于SAS软件,结合Plackett-Burman和Box-Behnken实验设计对5种培养基组分进行优化。结果表明,最佳培养基组分为胰蛋白胨11.16 g/L,酵母提取物20 g/L,甘油6.3 g/L,磷酸氢二钾16.38 g/L,磷酸二氢钾2.31 g/L。采用优化后的培养基进行摇瓶发酵,ADI酶活达到5.7 U/m L发酵液,比初始培养基(3.72 U/m L发酵液)提高了1.53倍,比LB培养基(2.83 U/m L发酵液)提高了2.01倍。采用优化后的培养基在3 L发酵罐中进行发酵,ADI酶活达到15.17 U/m L发酵液,较LB培养基(4.32 U/m L发酵液)提高了3.51倍。     

基于人工神经网络和遗传算法的普鲁兰酶重组大肠杆菌高密度发酵工艺优化

基于人工神经网络和遗传算法,对重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL 21表达热稳定普鲁兰酶的高密度发酵工艺进行优化.在5?L的发酵罐中,通过比较不同发酵温度、pH值及培养基碳氮比(C/N,mol/mol)对细胞量和产物产量的影响,确定最佳发酵工艺.结果表明,诱导前适合细胞生长的发酵条件为发酵温度34.4...     

重组短小芽孢杆菌CotA漆酶的酶学性质及发酵优化研究

细菌漆酶具有良好的热稳定性和抗碱性环境能力,在工业废水处理和染料脱色方面具有很大的潜力。通过研究短小芽孢杆菌W3菌株的CotA漆酶基因在大肠杆菌中重组表达的酶学性质,对其发酵培养基进行优化,以提高产量。利用分子手段实现CotA漆酶基因在大肠杆菌中的重组表达,并利用BP神经网络建模和萤火虫算法寻优对CotA漆酶发酵培养基进行优化,最后重组表达的CotA漆酶进行染料脱色研究。结果表明,重组菌株表达的CotA漆酶具有良好的热稳定性和耐碱能力,最适反应pH值为3.5,最适反应温度为80 ℃。重组CotA漆酶对底物ABTS具有良好的亲和能力,Km为0.247 mmol/L,Kcat为41.32 s ^-1。在适宜条件下的重组CotA漆酶的表达量为1 915.3 U/L,使用BP神经网络和萤火虫算法优化培养基获得最佳的发酵培养基配方为：蛋白胨1.16 g/dL、酵母粉0.428 g/dL、NaCl 1.06 g/dL、CuSO ₄ 0.274 mol/L和甘油（体积分数）0.931%。优化过的培养基产CotA漆酶酶活为3 088.68 U/L,相比未优化之前提高了61.26%。重组表达的CotA漆酶对孔雀石绿和酸性蓝129脱色效果明显,达到90%脱色率。短小芽孢杆菌W3来源的CotA漆酶具有良好的酶学性质和工业应用前景。利用BP神经网络偶联萤火虫算法寻优是CotA漆酶发酵培养基优化的有效手段。     

黄杆菌肝素酶I基因的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到pET-22b表达载体中。重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS-PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因。     

利用重组大肠杆菌发酵生产L-茶氨酸

L-茶氨酸是茶叶中一种独特的非蛋白质氨基酸。γ-谷氨基甲酰胺合成酶可以催化L-谷氨酸、乙胺和ATP合成L-茶氨酸,但反应成本较高。为了提高L-茶氨酸的生产效率,该研究开发了直接发酵生产L-茶氨酸的新方法。首先,在大肠杆菌基因组上双拷贝Methylovorus mays来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因gmas,获得了一株遗传稳定的用于L-茶氨酸生产的重组菌株。其次,在5 L罐中采用流加乙胺的方式发酵20 h,L-茶氨酸产量达到30. 45 g/L,糖酸转化率达到20.17%。最后,根据L-茶氨酸的物化性质拟定出合适的分离提取路线,从发酵液中获得了98.51%纯度的L-茶氨酸成品,总提取收率可达到70.34%。该方法操作简单,原料成本较低,具有较好的工业应用前景。     

重组大肠杆菌产脂肪氧合酶发酵条件优化

为进一步提高重组大肠杆菌（pET-23a-pse-LOX）产脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）的酶活力,利用响应面法对其发酵条件进行优化。通过单因素试验确定诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、接种量、培养基初始pH值和装液量对其发酵产酶的影响。在此基础上,采用Plackett-Burman试验设计从7 个因素中筛选出对LOX产量具有显著效应的因素为诱导时机、诱导时间和培养基初始pH值,并利用Box-Behnken试验设计和响应曲面法分析以确定其产酶的最优发酵条件,即诱导时机为菌液OD600 nm达到1.6、诱导时间34 h、培养基初始pH 7.0。在此条件下,LOX酶活力为（21 261.60±264.03） U/mL,比优化前的（13 553.96±46.64） U/mL提高了56.87%。     

重组大肠杆菌产淀粉分支酶的发酵条件探索

淀粉分支酶可增加淀粉的α-1,6-糖苷键,从而改善淀粉的理化特性和生理功能。本文以可胞内表达Geobacillus thermoglucosidans淀粉分支酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-20b(+)/be)为研究对象,首先研究了超声波提取胞内淀粉分支酶的条件,结果显示,当超声波输出功率为325W,总工作时间为15min,菌液OD600为1.4时,超声波破壁效果最佳。在此基础上,对重组大肠杆菌产淀粉分支酶的摇瓶发酵条件进行了探索,结果表明,最适发酵培养基为TB,初始pH为7.0,在25℃、IPTG浓度为0.01mmol/L下诱导培养12h,发酵所得菌体经超声后产生的淀粉分支酶总酶活最高为222.4U/mL。     

重组大肠杆菌产青霉素酰化酶的发酵动力学研究

对产青霉素酰化酶重组大肠杆菌M3进行分批发酵动力学研究。根据Logistic和Luedeking-Piret方程,拟合出重组大肠杆菌M3分批发酵过程中菌体生长、青霉素酰化酶合成、基质消耗的动力学模型及模型参数。结果表明,重组大肠杆菌M3产青霉素酰化酶的发酵动态过程能很好的被该模型所表达。     

重组大肠杆菌生产人血管抑素的发酵条件

对重组人血管抑素表达菌株pQE32 AGN的生长及产物表达规律进行了探索,确定了最佳发酵条件.培养温度为37℃,初始pH7.0,OD600为0.8～1.0时开始诱导,诱导持续时间为6h,诱导剂浓度为0.1mmol/L,最终目的产物达到菌体总蛋白的35%,rhAGN的表达量达到560mg/L.     

重组大肠杆菌产双乙酰还原酶的发酵条件优化

光学纯2,3-丁二醇是重要的手性合成砌块。采用双乙酰还原酶催化还原双乙酰底物是一种合成光学纯2,3-丁二醇的绿色方法。作者在摇瓶中对产双乙酰还原酶重组大肠杆菌的发酵培养基及诱导条件进行了优化。优化后的发酵培养基组成为:甘油5 g/L,酵母浸膏10 g/L,鱼粉蛋白胨5 g/L,(NH_4)_2SO_41.5 g/L,柠檬酸钠5 g/L,KH_2PO_41 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,NaCl 2 g/L;优化后的诱导条件为37℃,IPTG终浓度为0.1 mmol/L。在优化培养基中,37℃和0.1 mmol/L IPTG条件下诱导发酵6 h,单位菌体(干重)产双乙酰还原酶量达13.84 kU/g,产酶水平达33.65kU/L,分别为基础培养基的2.04和4.23倍,LB培养基的1.16和1.71倍。在此最优条件,在3 L发酵罐中进行了重组大肠杆菌产双乙酰还原酶的验证,发酵8 h时酶活最高,单位菌体产双乙酰还原酶量达14.09 kU/g,产酶水平达64.62 kU/L。本研究为高效制备可用于不对称还原合成光学纯2,3-丁二醇的双乙酰还原酶奠定了基础。     

重组大肠杆菌生产人表皮生长因子的发酵条件

通过质粒转化实验,获得了较好的产hEGF重组菌,对重组菌发酵条件进行优化,获得最佳初始糖质量浓度为5g/L、蛋白胨20g/L、酵母抽提物10g/L、(NH4)2HPO43.5g/L、Amp100mg/L;最佳接种时间为种子液生长到5～6h,即菌体OD值在1.0～2.0;诱导剂最佳添加时间为8h,即菌体OD值在8.0左右.通过流加发酵进行高密度培养,可使重组菌的hEGF的产率达102mg/L,比优化前提高了近30%.     

重组大肠杆菌产谷氨酰胺转氨酶的发酵条件优化

以谷氨酰胺转氨酶生产菌株重组大肠杆菌BL21（DE3）/mtg为研究对象,对工程菌的发酵产酶条件进行了优化。首先通过单因素实验法,对培养基碳、氮源种类及浓度、培养温度、初始p H、装液量、接种量、诱导时机、诱导浓度、诱导温度及诱导时间进行了优化;随后采用Plackett-Burman设计从中筛选出3个关键影响因子:初始p H、培养温度及诱导温度;最后通过Box-Benhnken设计建立上述3个因子对谷氨酰胺转氨酶比酶活的响应面模型。结果表明,最佳发酵条件为:葡萄糖5 g/L,酵母粉28 g/L,蛋白胨14 g/L,培养温度34℃,初始p H7.0,装液量50 m L（250 m L三角瓶）,接种量5%,诱导时机4 h,IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导温度25℃,诱导时间14 h。在该条件下,优化后的谷氨酰胺转氨酶比酶活达1.507 U/mg,为未优化前的1.56倍。      

嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了在3L发酵罐水平上提高重组菌E.coli BL 21(DE3)/pET20b(+)-BapulA的普鲁兰酶的表达量和胞外分泌,将嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶(Bacillus acidopullulyticus)在大肠杆菌中进行重组表达,并在3L发酵罐水平上对重组菌进行发酵优化,考察了发酵条件对重组酶表达的影响。重组菌发酵的最佳条件为:发酵前期菌体生长温度和pH分别为30℃和7.0,当菌体浓度OD_(600)达到50时,发酵温度降低至25℃,此时调节pH为6.2,同时开始流加乳糖[0.4g/(L·h)]进行诱导;在发酵过程中,当菌体浓度OD_(600)依次达到15,45,75时,分别加入浓度为1.5g/L的甘氨酸,当菌体OD600为105时,再加入浓度为3g/L的甘氨酸。发酵结束后普鲁兰酶的胞外酶活达659.0U/mL,最高总酶活达1 910.1U/mL,与摇瓶的初始总酶活(41.1U/mL)和胞外酶活(6.5U/mL)相比,分别提高了45.4倍和100倍。