利用EHEC琼脂平板从食物中分离检测产志贺毒素大肠杆菌

为利用肠出血性大肠杆菌(EnterohaemorrhagicEscherichiacoli,EHEC)琼脂平板,从食物中分离、检测产志贺毒素大肠杆菌(shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC),采用STEC毒力基因(hlyA基因)检测溶血素的产生,建立了一种利用EHEC琼脂平板快速、准确地从食物中分离、检测STEC的方法。该方法可检测STEC不同血清O157∶H7、O26、O111。     

产志贺毒素大肠杆菌O26多重双启动寡核苷酸引物-PCR检测方法的建立

为建立一种三重DPO-PCR方法用于食品样品中的产志贺毒素大肠杆菌O26的检测。以志贺毒素stx1和stx2、O抗原基因wzx O26特异性和实际检测效果,设计引物,构建三重DPO-PCR反应体系,进行特异性、灵敏度、模拟样品验证和实际样品验证。结果表明,三对DPO引物对退火温度不敏感,在49~69℃之间均能发生扩增,且引物之间干扰较小,具有较高的特异性,除目的基因外非目标细菌均无扩增条带出现,纯菌灵敏度检测表明,三重DPO-PCR方法对O26的最低检测限为3.8×10^3 cfu/g。在模拟样品和实际样品中具有良好的检测效果。本研究基于DPO引物构建的三重DPO-PCR方法具有效率高,特异性强,不受退火温度限制等优点,可用于食品样品中产志贺毒素大肠杆菌O26的快速准确检测提供一种高效的辅助检测方法。     

不对称PCR技术结合免疫层析法快速检测产志贺毒素大肠埃希氏菌

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)可分泌志贺毒素,致病性强,建立简便快速的STEC检测方法对控制食源性疾病的发生和蔓延极为重要.使用生物素标记STEC的标志性毒力基因stx1与stx2的下游引物进行不对称聚合酶链式反应,获得生物素化的目标单链...     

基于酸处理的产志贺毒素大肠埃希菌选择性增菌方法研究

目的 开发一套基于酸处理的产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)选择性增菌方法,提高食品中STEC菌株的检出率.方法 选择12株不同血清型STEC菌株及13株常见干扰菌,评价其对不同酸处理条件(pH=2.0、2.5、3.0)的耐受性;考察筛选的酸处...     

食源性产志贺毒素大肠杆菌的分离及菌株特征分析

了解不同食品中产志贺毒素大肠杆菌的流行情况、菌株特征及潜在致病性。方法 对我国不同地区采集的355份食品样品进行产志贺毒素大肠杆菌分离鉴定,对菌株进行stx1/stx2基因分型、eae等毒力基因检测,并对菌株进行多位点序列分型(MLST)分析。结果 355份样品中44份stx2基因阳性,共分离出11株非O157 产志贺毒素大肠杆菌,其中3株携带stx2a亚型,3株携带stx2e亚型,1株携带stx2b亚型,4株不能分型;5株携带ehxA、saa毒力基因,2株携带subA基因,1株携带katP基因;MLST将11株菌分为7个不同的ST型,存在与溶血性尿毒综合症患者肠出血性大肠杆菌分离株(HUS-associated enterohemorrhagic E.coli,HUSEC)及主要流行血清群产志贺毒素大肠杆菌亲缘关系较近的ST型别。结论 我国食品中存在一定程度的非O157产志贺毒素大肠杆菌污染,部分菌株具有潜在致病性,应加强对食品中STEC的监测。     

可视化环介导等温扩增法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌

为建立一种快速、简单、灵敏的产志贺毒素大肠埃希氏菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）检测方法,本研究以stx基因作为检测靶基因和利用羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue,HNB）指示剂建立了一种STEC的可视化环介导等温扩增（Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP）方法。根据GenBank公布的STEC菌株stx1和stx2基因核苷酸序列为靶序列,分别设计并合成五组特异性LAMP引物,优化反应条件和体系,进行特异性和灵敏度试验。同时,将建立好的LAMP方法与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测方法相比较,并对人工污染STEC的脱脂乳进行检测。结果表明,建立的可视化LAMP方法在64℃反应50 min后可凭肉眼观察（紫罗兰色到天蓝色）判定结果。该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应,可以准确区分STEC与非STEC菌。灵敏度的检测结果表明,stx1-LAMP和stx2-LAMP检测方法的检测限分别为3.54×10-4 ng/μL和3.54×10-5 ng/μL,而常规PCR的检测限stx1和stx2分别为3.54×10-3 ng/μL和3.54×10-2 ng/μL,即stx1-LAMP检测方法的灵敏度是stx1-PCR的10倍,stx2-LAMP检测方法的灵敏度是stx2-PCR的1000倍。对人工污染STEC菌牛奶样品进行检测,stx1-LAMP和stx2-LAMP分别可检测到细菌浓度为103 CFU/mL和102 CFU/mL的加标样品。本研究为STEC菌株提供了一种特异性强、灵敏度高、成本低,适用于现场和基层检测的可视化LAMP 检测方法。     

多重实时聚合酶链式反应法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌

目的 建立多重实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)法快速检测食品中的产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli, STEC)的方法。方法 以产志贺毒素大肠埃希氏菌携带的毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae靶基因引物探针建立多重实时PCR体系, 并采用原位冻干技术将PCR反应体系和阳性质控品进行了预先分装冻干, 制成稳定、便捷的即用型反应体系, 随后对方法的灵敏性、特异性和稳定性进行评价。结果 所建立的多重实时PCR法检测eae、stx1、stx2基因的灵敏性为102 CFU/mL。与32种非STEC菌均无交叉反应。整体检测时长可控制在1 h以内, 冻干体系可在常温条件下保存1年以上。结论 本方法快速、简便, 适用于测定食品中的STEC。     

伊犁地区肉牛源产志贺毒素大肠杆菌的血清型和ERIC-PCR基因型研究

目的:了解产志贺毒素大肠杆菌在伊犁地区肉牛养殖环境和加工环节中的污染状况及其遗传多样性,为产业链中食源性致病性大肠杆菌的风险监测和控制提供基础数据。方法:采用传统方法和PCR方法对养殖环节的饲草料和粪便及屠宰环节的553份样品进行产志贺毒素大肠杆菌的污染调查,对分离鉴定的产志贺毒素大肠杆菌进行7种常见血清型（O145、O157、O45、O103、O111、O26、O121）的PCR检测和ERIC-PCR的基因分型。结果:检测553份样品中有39株编码志贺毒素基因,产志贺毒素大肠杆菌（STEC）的检测率是7.1%。常见血清型PCR检测中血清型O111有2株菌,检出率是5.1%;O145有5株菌,检出率是12.8%。ERIC-PCR基因分型产志贺毒素大肠杆菌有10种基因亚型,分成3簇,A簇有23株菌,相似性在59%¹00%,表明这些菌株之间的亲缘关系较近。结论:伊犁地区肉牛粪便是产志贺毒素大肠杆菌的污染源,这些菌株的亲缘关系较近。      

Prevalence of the main food-borne pathogens in retail food under the national food surveillance system in Japan

The National Food Surveillance System in Japan was formed in 1998 to monitor the contamination of retail foods with bacterial pathogens. Approximately 2000–3000 samples were tested annually, and the data from food categories that had more than 400 samples collected during 1998–2008 were analysed. With regard to meat, the frequency of positive samples for Salmonella in chicken for raw consumption and ground chicken was 12.7% and 33.5%, respectively. Moreover, Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O157 was found in ground meat, organ meat and processed meat, although at a low frequency (0.1%). The prevalence of Campylobacter jejuni/coli was 13.3% and 20.9% in chicken for raw consumption and ground chicken, respectively. In vegetables and fruit, Salmonella was detected in cucumber, lettuce, sprout and tomato samples at a frequency of around 0.1–0.2%. With regard to seafood, Salmonella was found in 0.5% of oysters for raw consumption. Seafood was not contaminated with STEC O157 or Shigella. Serotype Infantis was the most frequently detected serotype of Salmonella in seafood, followed by the serotypes Typhimurium, Schwarzengrund and Manhattan. In ground chicken, 72.2% of the strains were identified as the serotype Infantis. E. coli, as an indicator of food hygiene, was detected in all food categories. The results show the prevalence of the above-mentioned pathogens in the retail food supplied in Japan; further, they indicate that consumption of raw food carries the risk of contracting food-borne infections.     

重组酶聚合酶扩增检测产志贺毒素大肠埃希菌的微流控芯片技术

采用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),开发产志贺毒素大肠埃希菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)的等温检测方法,结合圆盘式微流控芯片快速检测目标微生物.以stx1和stx2基因为靶点,设计和筛...     

食用农产品中产志贺毒素大肠埃希菌污染与家庭厨房食物安全现状分析及防控措施

本文通过对食用农产品中产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)来源与传播途径分析,阐述了STEC污染与家庭厨房食物安全之间的关系,并对当前世界各国食品中STEC的监管情况进行阐述,从而提出我国控制食用农产品中STEC进入家庭厨房的解决方案。     

Commercially Available Rapid Methods for Detection of Selected Food-borne Pathogens

Generally, the enumeration and isolation of food-borne pathogens is performed using culture-dependent methods. These methods are sensitive, inexpensive, and provide both qualitative and quantitative assessment of the microorganisms present in a sample, but these are time-consuming. For this reason, researchers are developing new techniques that allow detection of food pathogens in shorter period of time. This review identifies commercially available methods for rapid detection and quantification of Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, and Shiga toxin-producing Escherichia coli in food samples. Three categories are discussed: immunologically based methods, nucleic acid-based assays, and biosensors. This review describes the basic mechanism and capabilities of each method, discusses the difficulties of choosing the most convenient method, and provides an overview of the future challenges for the technology for rapid detection of microorganisms.     

LAMP实时浊度法快速检测食品中产志贺毒素大肠埃希氏菌

针对产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)stx1和stx2基因的特异性序列分别设计4条特异性引物,采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,利用实时浊度仪建立食品中STEC的LAMP实时浊度法快速检测方法。LAMP反应在实时浊度仪63℃恒温下1 h可完成。对方法的特异性、灵敏度、稳定性进行了评价,并在实际样品检测中进行应用。经优化该方法的检测灵敏度可达150拷贝/反应,4株STEC菌株LAMP扩增结果与其基因型一致,其他21株非STEC菌株均未出现非特异性扩增。395份食品样品检出STEC阳性68份(阳性率为17.2%),所检食品类别中畜产品阳性率最高(达31.3%),禽产品、水产品和可生食蔬菜均有少量阳性样品检出,阳性样品中以stx2基因阳性型为主。结果表明,LAMP实时浊度法具有快速、灵敏、特异性强、操作简便的优势,适用于食品中STEC的快速筛查。     

武汉市部分菜场肉类食品中产志贺毒素大肠杆菌污染状况分析

对武汉市部分菜场肉类食品中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)污染状况进行分析。方法 2011年7月至2012年10月期间,从武汉市汉口30个菜场和超市共采集样品196份,其中猪肉102份,牛肉60份,禽类34份。通过选择性增菌,提取DNA,PCR扩增stx1、stx2、rfbO157、wzyO157基因,分析食品中产志贺毒素大肠杆菌的污染状况。结果 猪肉、牛肉、禽类食品中非O157型STEC的阳性检出率分别为18.6%、48.4%和2.9%;O157型STEC的阳性检出率分别为13.6%(猪肉)、6.7%(牛肉)和2.9%(禽类)。菜场样品STEC检出率(35.8%)略高于超市样品(32.4%)。结论 武汉市肉类食品中STEC检出率较高,应定期跟踪监测,了解菌株流行和毒力变化状况。     

检测产志贺毒素大肠杆菌的菌落PCR方法

针对产志贺毒素大肠杆菌的毒力基因stx 设计特异性引物,并建立一种菌落PCR 方法。菌落PCR 模拟实验证实,该方法特异性强,能良好的扩增出O157 的stx1 和stx2 基因,而普通大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌则无PCR 扩增产物。应用分子检测初筛、选择性培养、菌落PCR 相结合的方法,检测实际食品样品,分离检测到一株携带 stx1 的产志贺毒素大肠杆菌。本实验建立的菌落PCR 方法可应用于食品检验。     

免疫磁珠富集联合荧光定量PCR快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌O26∶H11

建立肉制品中免疫磁珠富集(IMS)联合实时荧光定量PCR(qPCR)技术快速检测牛肉馅中产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O26∶H11的方法。方法 建立针对编码O26抗原wzx基因实时荧光定量PCR方法,并验证其特异性和敏感性;人工污染不同浓度STEC O26∶H11的牛肉馅样品,在增菌不同时间后,将增菌液原液、增菌液经免疫磁珠特异性捕获分离物分别进行qPCR检测及平板分离。结果 qPCR检测O26∶H11可产生特异性荧光信号,而23株其他血清型的大肠埃希菌及7株其他种属细菌均未见荧光信号;本方法对纯培养的检测限为5×10^2cfu/ml。人工染菌试验中,当初始染菌浓度达到或高于3×10^2cfu/25g时,增菌培养6h后IMS捕获物可以检测到荧光信号。培养20h后,初始染菌浓度为3SymboltB@10-1 cfu/25g以上,对增菌液直接检测和IMS捕获物检测都可以检测到荧光信号。初始污染浓度较低时,增菌6h后IMS-qPCR的检测灵敏度高于增菌液直接qPCR检测;IMS捕获物涂布显色培养基分离目标菌检测灵敏度高于增菌液直接涂布;CHROMagar STEC显色培养基分离STEC O26∶H11的检测灵敏度高于山梨醇麦康凯培养基(SMAC)。结论 IMS联合qPCR检测食品中的STEC O26∶H11具有特异性强、敏感度高、快速、易操作等特点,可以提高样品中STEC O26∶H11菌的检出率,适用于牛肉制品中STEC O26∶H11的快速检测。     

山东省动物源性产志贺毒素大肠埃希菌血清型和耐药特征分析

目的 了解山东省动物源性产志贺毒素大肠埃希菌（STEC）的分子特征和耐药特征,为STEC感染风险评估及监测提供依据。方法 对山东省2017—2018年分离鉴定的140株牛和羊来源STEC菌株,采用微量肉汤稀释法测定其对15类27种抗生素的最小抑菌浓度,采用双纸片协同试验进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）检测;对所有菌株进行全基因组测序,并基于全基因组序列进行O：H血清型、志贺毒素亚型和耐药相关基因分析,构建最大似然法的Core Gene SNP系统进化树。结果 140株STEC组成45种不同O：H血清型,其中O157：H7占12.86%（18/140）;共检出2种stx1亚型和8种stx2亚型,以stx1c+stx2b亚型为主,其次是stx2k新亚型。16株菌（11.43%）对至少1种抗生素耐药,4株（2.86%）为多重耐药。牛和羊来源的STEC对四环素耐药率最高（8.57%,12/140）,其次是复方新诺明（6.43%,9/140）,3株为产ESBLs菌株;所有菌株对美罗培南和阿米卡星均敏感;共检出10类25种耐药相关基因,包括β-内酰胺酶类耐药基因bla_EC、bla_CTX、bla_TEM和bla_OXA,并首次从STEC中检出磷霉素耐药基因fosA7。140株STEC形成了38个簇,每个簇包含了相同的血清型,血清型为O113：H4型的菌株为优势簇。结论 山东省牛和羊携带的STEC菌株以非O157为主,具有高度多样性,存在fosA7新耐药基因型及携带多种耐药基因的多重耐药菌株,应加强牛羊粪便管理和病原菌监测。     

O26等产志贺毒素的6 种血清型大肠杆菌的暴发流行情况及检测研究现状

近年来,产志贺毒素而非O157的大肠杆菌,尤其是被美国农业部称为“the Big Six”的6 种大肠杆菌在诸多国家及地区暴发流行,严重威胁人类的健康,越来越受到世界各国的关注。“the Big Six”包括大肠杆菌O26、O45、O103、O111、O121、O145等6 种血清型。目前,在国内,关于“the Big Six”的报道及研究相对较少。文中介绍“the Big Six”的暴发流行情况,并对各种检测方法进行综述。     

Prevalence and characteristics of Shiga toxin-producing Escherichia coli in Swiss raw milk cheeses collected at producer level

The aim of this study was to describe the prevalence, serotypes, and virulence genes of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolated from raw milk cheese samples collected at the producer level with the purpose of determining whether raw milk cheeses in Switzer-land represent a potential source of STEC pathogenic for humans. Raw milk cheese samples (soft cheese, n = 52; semihard and hard cheese, n = 744; all produced from Swiss cows’, goats’, and sheep's milk) collected at the producer level throughout Switzerland within the national sampling plan during the period of March 2006 to December 2007 were analyzed. Of the 432 cheese samples obtained in the year 2006 and the 364 samples obtained in the year 2007, 16 (3.7%) and 23 (6.3%), respectively, were found to be stx positive. By colony dot-blot hybridization, non-O157 STEC strains were isolated from 16 samples. Of the 16 strains, 11 were typed into 7 E. coli O groups (O2, O15, O22, O91, O109, O113, O174), whereas 5 strains were nontypeable (ONT). Among the 16 STEC strains analyzed, stx₁ and stx₂ variants were detected in 1 and 15 strains, respectively. Out of the 15 strains with genes encoding for the Stx2 group, 4 strains were positive for stx₂, 6 strains for stx_2d2, 2 strains for stx_2-O118, 1 strain for stx_2-06, 1 strain for stx_2g, 1 strain for stx₂ and stx_2d2, and 1 strain for stx₂ and stx_2g. Furthermore, 3 STEC strains harbored E-hlyA as a further putative virulence factor. None of the strains tested positive for eae (intimin). Results obtained in this work reinforce the suggestion that semihard raw milk cheese may be a potential vehicle for transmission of pathogenic STEC to humans.     

多重耐药与药物敏感型大肠杆菌在牛肉中生长预测模型的研究

本文以多重耐药与药物敏感大肠杆菌为研究对象,将其分别接种到新鲜牛肉中,置于10℃、20℃、30℃、40℃温度下培养,利用25℃和35℃两个温度作为验证。运用Origin 8.0建立一级和二级模型,得出这两种大肠杆菌在不同温度条件下的最大比生长速率与迟滞期。结果表明:修正的Gompertz模型和修正的Logistic模型可以很好地模拟牛肉中多重耐药与药物敏感型大肠杆菌在不同温度下的生长情况(R20.95),其中药物敏感型大肠杆菌的迟滞期比多重耐药型大肠杆菌短。采用Belehradek模型说明模型中的参数值(U和LPD)与温度之间的函数关系,温度与最大比生长速率呈现线性关系。利用建立的生长动力学模型求得25℃和35℃的最大比生长速率,与实际值比较,二者相对误差较小,证明建立的模型可靠。本研究为控制牛肉中大肠杆菌提供理论依据。