迟钝爱德华氏菌FimA基因的克隆及序列分析

以迟钝爱德华氏菌Et、XA、EA分离株的DNA为模板,采用PCR技术,扩增菌毛亚基(FimA)基因的DNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:Et、XA、EAFimA基因由534个核苷酸组成,编码177个氨基酸。Et、XA、EA之间FimA基因核苷酸同源性为99%,与其它分离物核苷酸同源性为76%～77%,氨基酸同源性为81%～82%。     

茶叶多酚氧化酶基因克隆与序列分析

以天然无咖啡碱南昆山毛叶茶、英红9号和福云6号三个茶树品种为研究材料,采用同源克隆法,根据已克隆的植物多酚氧化酶基因的序列分析,设计特异引物,从三个茶树品种中克隆获得多酚氧化酶基因全长,分别编码595、599和597个氨基酸。序列比较分析表明,茶树多酚氧化酶基因的核苷酸序列同源性高于92.6%,氨基酸序列同源性高于94.6%,并包含两个富含组氨酸的铜离子保守区域。     

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。     

滁菊类黄酮3′-羟化酶基因的克隆及分子特性

以安徽滁州地区特有的药食两用植物资源——滁菊(Dendranthema morifolium‘chuju’)为试材,采用同源基因克隆方法克隆滁菊类黄酮3′-羟化酶基因(flavonoid 3′-hydroxylase,f3′h),NCBI注册号HQ256697。结果表明:采自不同地点的滁菊样品均能扩增出一条长381bp的f3′h基因片段,该片段与探针序列GU249553第3外显子对应区域的核苷酸序列同源性达98.69%,同源区域内有5个单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNP),其中3个SNPs导致氨基酸编码序列的改变。滁菊与葡萄属(Vitis vinifera)、高粱属(Sorghum bicolor)、芸苔属(Brassica napus)、牵牛属(Ipomoea nil Magenta)、苹果属(Malus×domestica)、番薯属(Ipomoea purpurea)等物种f3′h基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在60%～98%和68%～97%之间。不同植物f3′h基因的分类与物种间的亲缘关系存在明显的相关性,菊属植物f3′h基因在系统进化中处于较高位置。     

狗头枣ACC I氧化酶基因的克隆及其序列分析

为利用RNAi技术开展调控乙烯合成延迟狗头枣果实成熟等研究,以狗头枣试管苗叶片的总DNA为模板,根据冬枣ACC I氧化酶基因的序列设计引物,通过PCR方法获得一长1 294 bp片段,序列分析结果表明,该片段具有4个外显子和3个内含,依次在106~201、430~541 bp与877~1 002 bp碱基处。此序列与冬枣ACC I氧化酶基因(EU216549.1)的核苷酸和氨基酸序列同源性均为99.69%,表明成功地克隆了狗头枣ACC I氧化酶基因。     

2种山葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆与序列分析

目的:白藜芦醇合酶(resveratrol synthetic enzyme,RS)是植物白藜芦醇合成途径中的关键酶,为获得高效表达的白藜芦醇合酶基因,方法:利用已知的葡萄RS基因(AF274281)序列设计并合成一对引物,以2种不同来源的山葡萄叶片基因组DNA为模板,PCR扩增包含RS完整基因在内的一段序列;在此基础上采用悬挂延伸PCR法分别克隆目的基因。结果:测序与序列分析表明,RS全长基因片段大小均为1 536bp,其中包含一个内含子及两个外显子,同源性比较,其内含子碱基变化较大。悬挂延伸PCR法克隆获得的目的基因,开放读码框分别为1 170 bp和1 182bp,编码389/392个氨基酸残基,命名为CNRS1、CNRS3。同源性比较发现,CNRS1、CNRS3与已知葡萄RS基因序列的同源性分别为98%、97.5%。结论:以上结果证实CNRS1、CNRS3属葡萄RS基因家族成员,为今后进一步对该基因的研究与利用打下了基础。     

山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶cDNA克隆及序列分析

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)具有明显的抗氧化活性,避免细胞膜受到过氧化损伤。本研究利用RACE技术,克隆出山参phgpx基因全长c DNA。序列分析表明:该克隆片段全长490 bp,编码162个氨基酸,有3个真核生物PHGPx特有的保守亚结构域。该片段编码的蛋白为跨膜亲水性稳定蛋白质,与柑橘、蓖麻等PHGPx氨基酸序列同源性分别为76%和75%。同时建立了9种植物的系统进化树。     

苦荞和甜荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（Dfr）的克隆及序列分析

采用同源基因克隆的方法,以苦荞和甜荞叶片为材料,提取总RNA,经RT-PCR 扩增获得其二氢黄酮醇4- 还原酶基因(dfr)cDNA 序列,并通过T 载体克隆后测序。序列分析表明,获得了苦荞和甜荞dfr 的全长cDNA编码序列,其1026bp 的全长开放阅读框(ORF)均编码341 个氨基酸,并具典型的dfr 结构特征和功能模块。同源性分析显示,苦荞和甜荞与其他植物的dfr 基因核苷酸相似性为71%～98%;根据氨基酸序列构建系统进化树表明,二者与豆科、桑科和蔷薇科聚为一类。     

盐藻八氢番茄红素合成酶基因组DNA的克隆及序列分析

八氢番茄红素合成酶(PSY)为盐藻β-胡萝卜素代谢途径中的一个关键酶。通过染色体步移技术，采用抑制性PCR，从盐藻基因组DNA中克隆到完整的PSY基因，并对其序列进行了分析。该PSY基因序列全长3315bp，由5个外显子和4个内含子组成。其编码区的氨基酸序列与巴氏杜氏藻相应序列的一致性最高为74％，不一致区主要集中在5’端。同源性分析表明盐藻与巴氏杜氏藻的亲缘关系最近。     

钝裂银莲花居群遗传多样性及其与生态因子相关性

采用RAPD技术分析了4个地区(合作、碌曲、玛曲、阿孜)不同花色(黄、浅、白)11个钝裂银莲花居群的遗传结构。结果表明:钝裂银莲花居群遗传多样性较高,Shannon多样性指数(I)为0.6025,Nei’s基因多样性指数(H)为0.4166,Nei’s基因分化系数(Gst)和AMOVA分析表明钝裂银莲花居群间分化程度较低,大部分变异存在于居群内(67%),居群间占一小部分(33%)。对不同居群进行UPGMA聚类分析,结果显示11个亚居群可以归为3大支。相关性分析表明遗传多样性与地理分布和土壤营养状况有相关性。     

扁果枸杞肌动蛋白基因片段的克隆及其表达特征分析

为克隆扁果枸杞(Lycium barbarum Bianguo)肌动蛋白基因作为基因表达模式分析的内参基因,根据几种茄科植物肌动蛋白氨基酸序列保守区设计引物,以扁果枸杞3周龄叶总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增肌动蛋白基因片段并连接到p MD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后测序。结果表明,该基因片段长598 bp,编码198个氨基酸,与枸杞(Lycium chinense)核苷酸序列的相似度和同源性分别达97%和100%,说明是肌动蛋白基因片段,命名为Lb ACT。荧光定量PCR分析表明,盐处理下Lb ACT基因在各器官中的Ct值稳定,可作为内参基因用于研究扁果枸杞功能基因的表达模式分析。     

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn ZF-1基因克隆和序列分析

利用RT-PCR技术从黑曲霉XZ-3S中扩增并克隆了木聚糖酶(Xyn ZF-1)基因的cDNA片段,测序结果表明,Xyn ZF-1基因核苷酸序列阅读框全长678bp,编码225个氨基酸,推测分子量为24.06ku,等电点为5.20。以XZ-3S基因组DNA为模板扩增Xyn ZF-1的DNA序列,该序列仅存在一个内含子,长度为68bp。成熟肽基因推导的氨基酸序列与其他微生物来源的木聚糖酶一级结构进行比较,同源性最高达到了89.47%。系统进化树分析该酶属于G/11族糖基水解酶。又进一步对Xyn ZF-1二级结构进行了分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

盐藻八氢番茄红素合成酶基因组DNA的克隆及序列分析

八氢番茄红素合成酶(PSY)为盐藻β-胡萝卜素代谢途径中的一个关键酶。通过染色体步移技术,采用抑制性PCR,从盐藻基因组DNA中克隆到完整的PSY基因,并对其序列进行了分析。该PSY基因序列全长3315bp,由5个外显子和4个内含子组成。其编码区的氨基酸序列与巴氏杜氏藻相应序列的一致性最高为74%,不一致区主要集中在5'端。同源性分析表明盐藻与巴氏杜氏藻的亲缘关系最近。     

大豆rbcL基因克隆、序列分析及原核表达

利用叶绿体基因组保守性的特征,根据菜豆、豌豆、烟草的rbcL基因序列设计引物,从大豆叶绿体DNA中克隆rbcL基因,全长序列为1488bp,包括1449bp的开放阅读框,编码482个氨基酸。相似性比较显示,此序列与其它10个物种rbcL基因核苷酸的同源性为85．37％～95．31％,氨基酸的同源性为90．87％-96．47％。将该基因与表达载体pET-30a（＋）连接,转化大肠杆菌Rosseta感受态细胞,PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,阳性菌液IPTG诱导后经10％SDS—PAGE分析,结果显示,诱导表达出分子量约为60kD的特异融合蛋白。     

烟草CONSTANS同源基因的克隆与分析

日照长度影响植物的生长发育,在拟南芥中CONSTANS是植物光周期开花途径中的关键基因。利用同源序列法结合RACE 技术从短日照烟草品种Kutsaga.Mammoth10 中分离出了开花时间相关的CO(CONSTANS)同源基因,并命名为NtCO1(基因登录号JN022535.1)。经序列分析,NtCO1 全长1493 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,81~1292 bp),编码403 个氨基酸;具有CO 蛋白典型的结构域;氨基末端有两个B-box 结构,羧基末端有CCT 保守结构域。氨基酸同源性比对发现,NtCO1 与茄科CO 同源蛋白一致性最高,同马铃薯CO 序列一致性达到86.5%;与拟南芥CO 蛋白和水稻Hd1 氨基酸序列一致性也分别达到50%和43.7%。基因表达分析表明,NtCO1在叶片中优势表达,茎中次之,根中最弱     

优化简并引物PCR克隆Candida glycerinogenes 3-磷酸甘油脱氢酶基因片段

为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因(ctGPD),对不同酵母和其他真核生物的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶进行比对,分析氨基酸和核苷酸的保守序列,设计了4对简并引物用于扩增C.glycerinogenes的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)基因片段,经过优化PCR反应条件,利用其中一对中等简并度的引物扩增出CgGPI)基因中约600 bp的保守核心片段.DNA序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明,该基因片段与其他酵母的胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型的保守区域,并且与安格斯毕赤酵母的GPI)基因相似性较高.     

大豆GmNCED 1基因的克隆及表达模式分析

本研究以抗逆性强的大豆旱碱一号为材料,首次从中克隆了编码9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED）的GmNCED1基因全长cDNA片段,该基因编码区含有1836个核苷酸,编码611个氨基酸。通过同源性比对分析发现GmNCED1与花生、菜豆等双子叶豆科植物NCED的同源性高达84％以上。同时,利用荧光定量PCR分析发现高盐、低温、干旱、外源ABA以及NAA处理均可以诱导该基因在大豆叶片及根中表达。本研究初步揭示GmNCED1基因在植物逆境胁迫中的作用,为基因工程育种提供优质的候选基因。     

天然无咖啡碱茶叶N-甲基转移酶基因克隆与序列分析

本研究以天然无咖啡碱南昆山毛叶茶为主要研究材料,以不同咖啡碱含量的英红9号茶树品种和红山茶等山茶属植物为对照,采用RT-PCR技术,克隆获得南昆山毛叶茶、英红9号和福云6号茶树品种的NMT基因全长,分别编码365、369和369个氨基酸。序列比较分析表明南昆山毛叶茶NMT基因与其它茶树NMT基因的核苷酸序列同源性高于86.5%,氨基酸序列同源性高于86.3%,并包含了六个保守序列、三个SAM结合区A、B’、C及一个保守域VFFF。基于同源性比较,推测核苷酸序列的差异可能是导致南昆山毛叶茶NMT基因活性改变、影响茶树体内咖啡碱代谢的原因之一。     

黄花烟草K+通道基因NKCl克隆与序列分析

通过已知生物钾通道蛋白保守序列分析,设计兼并引物对钾饥饿处理的烟草幼根总RNA的反转录产物进行PCR扩增,分离到K 通道基因NKCl,该基因的cDNA阅读框由2481个核苷酸组成,编码的蛋白含有826个氨基酸(分子量为94.6KD),等电点为6.60;将核苷酸序列输入NCBI进行BlastX其同源序列大部分为高亲和K 转运体,与该基因同源性最高的是Solanum tuberosum钾通道基因SKT1,其氨基酸同源性为79%,预测该蛋白具有6个跨膜区域,采用同源模建方法预测了NKC蛋白活性区域的3维结构.同时,特异性转录分析发现NKCl基因在烟草幼根、叶片和花各器官均有表达,而以幼根组织中转录量最多;缺钾处理可显著诱导根系中NKC基因的转录,而高浓度NH4 处理对该基因的转录具有抑制作用,证实NKC基因在黄花烟草的钾吸收过程中起着重要作用.     

粟酒裂殖酵母降苹果酸基因克隆及其序列分析

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）由于可降解苹果酸（malo-ethanolic fermentation）而被广泛应用于葡萄酒等果酒的酿造。其生理活性依靠的是苹果酸通透酶（MAEI）和苹果酸酶（MAE2）2个关键酶的作用。以粟酒裂殖酵母基因组DNA为模板，采用聚合酶链式反应（PCR）技术，扩增得到苹果酸通透酶基因（mae1）和苹果酸酶基因（mae2），并插入到pMD—T载体中，转化大肠杆菌得到相应的转化子。测序后分析表明，扩增的mae1基因与mae2基因序列与已报道的序列同源性均为99％，mae1基因编码的氨基酸序列中有2个与报道不同；mae2基因编码的氨基酸中有3个与报道不同。