进口转基因抗Basta~(TM)除草剂油菜籽检测方法研究

建立了从油菜籽中提取总ＤＮＡ和用ＰＣＲ技术检测外源基因的方法，用该方法从进口油 菜籽中检出外源的草丁膦乙酰转移酶基因（ＰＡＴ）、新霉素磷酸转移酶基因（ＮｐｔＩＩ）、花椰 菜花叶病毒３５Ｓ启动子（ＣａＭＶ ３５Ｓ）。     

Saccharomy cescerevisiae氨基转移酶基因ARO8克隆及对3甲硫基丙醇合成的影响

酿酒酵母可通过艾希利(Ehrlich)途径将L-蛋氨酸转化为3-甲硫基丙醇等食品风味成分,本文研究了氨基转移酶及其基因在Ehrlich途径及3-甲硫基丙醇合成代谢的调控作用。从Saccharomyces cerevisiae S288C克隆氨基转移酶ARO8基因,并基于酿酒酵母-大肠杆菌穿梭型表达载体pYES-pgk,构建重组质粒表达载体pYES-pgk-ARO8,PEG/LiAc转化法将其导入S.cerevisiae S288C。结果表明,克隆的ARO8基因全长1503bp,与NCBI GenBank中酿酒酵母芳香族氨基转移酶Ⅰ编码基因ARO8的序列相似度为100%;构建的ARO8基因过表达工程菌S.cerevisiae AR8,其氨基转移酶活力为187U/mL,较野生型S288C菌株的酶活性提高1.63倍;工程菌AR8的摇瓶发酵3-甲硫基丙醇产量为0.76g/L,较野生型S288C提高28.8%。表明氨基转移酶Aro8p及其ARO8基因在S.cerevisiae 3-甲硫基丙醇合成代谢中发挥重要作用,增强其ARO8基因表达,有助于提高3-甲硫基丙醇的产量。     

多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

烟草糖基转移酶基因NtGT5a的克隆及原核表达

为揭示烟草糖基转移酶的活性及生物学功能,从烟草栽培品种中克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT5a,基于GenBank的烟草糖基转移酶基因NtGT5a的核苷酸序列(GenBank登录号AB176523),设计并合成特异性引物,以红花大金元叶片总RNA为模板,通过RT-PCR方法获得了烟草糖基转移酶基因NtGT5a的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1458 bp,编码485个氨基酸残基,推测的蛋白分子量为54.21 kDa,理论等电点为5.41。通过构建重组表达载体pCold-SUMO-NtGT5a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在15Ⅲ下经0.2 mmol/L IPTG诱导22 h表达产生了SUMO-NtGT5a重组蛋白。重组蛋白部分以包涵体形式存在,部分以可溶性蛋白形式存在。将重组蛋白的可溶性组分经过Ni-NTA柱层析纯化和凝胶过滤层析,用SUMO蛋白酶切除SUMO标签,再用镍柱纯化获得了高纯度的NtGT5重组蛋白。     

外源转基因片段从转基因棉籽壳到食用菌水平转移研究

研究利用转基因棉籽壳种植食用菌是否会导致外源转基因片段从棉籽壳水平转移到食用菌中。从银耳生产基地与菇厂采集15份银耳样品与10份平菇样品(培养基质中转基因棉籽壳含量分别约为75%与92%),用PCR扩增检测是否存在转基因棉籽壳中的外源片段CaMV 35S、NOS、CpTⅠ、Cry IA(c)。此外,针对可能会用含棉籽壳基质培养的市售食用菌,从上海市闵行区各大中型超市与农贸市场采集市售样品47份,用PCR扩增检测外源转基因片段。结果显示,不论是生产基地明确用转基因棉籽壳培养的银耳与平菇样品,还是市售的各类食用菌均未发现存在外源转基因片段向食用菌水平转移的现象。     

作物转基因成分检测能力验证结果与分析

目的 为提高农业转基因成分检测能力和水平, 保证检测质量, 更好地发挥检测机构在转基因生物安全管理中的技术支撑作用。方法 根据农业农村部公告的转基因检测方法的要求, 分别对编号为YZ180011、YZ180012、YZ180013和YZ180014样品进行检测。结果 检测到所有样品外源基因CaMV35S启动子均为阳性; YZ180012和YZ180014样品中, 外源基因bar均为阳性; YZ180011、YZ180012和YZ180013号样品中, 外源基因NOS终止子为阳性; 而YZ180012号样品, 外源基因pat为阳性; YZ180012和YZ180013号样品中, 外源基因FMV35S启动子和NPTⅡ均为阳性; YZ180011和YZ180012号样品中, 外源基因HPT为阳性。结论 本次能力验证获得结果为满意。     

五重PCR检测转基因大豆

旨在建立一套准确、快速、可靠的用于转基因大豆检测及DNA提取方法;以35S启动予(Cauliflowermosaicvirus 35S, CaMV 35S)、Nos终止子(Nopalinesynthase, Nos)、NPTⅡ、CP4-EPSPS四种外源基因和大豆内源基因(Lectin)为检测的目的片段,建立五重PCR反应体系,并采用改进的方法提取DNA,进行PCR扩增,实际检测了已知转基因大豆和市售大豆;改进的DNA提取方法与经典的CTAB方法相比,提取时间至少缩短了1h,降低了提取成本.经过PCR扩增对五种外源基因进行了检测,经DNA测序证实了产物为目的扩增产物.转基因大豆的检出限为0.2%～0.5%.改进后的DNA提取方法能够快速提取用于PCR扩增的高质量模板,消除了PCR反应的抑制因子;建立的五重PCR反应体系能够高效、准确的检测转基因大豆.     

粉丝类产品中转基因成分的检测

本实验采用改良的简易CTAB法从深加工产品粉丝中获得高纯度和高浓度的DNA.以CaMV358、FMV35S、nos、nptⅡ、pat、bar 6个外源基因作为筛选基因,优化反应条件和反应参数,建立了粉丝类产品中转基因成分的实时荧光PCR检测方法.该方法灵敏、特异,其推广应用对于促进粉丝类产品出口和加强转基因食品监管工作,具有重要意义.     

9种大豆制品中转基因成分定性PCR检测

本研究从豆粕、豆粉、豆腐等9种大豆产品中提取到高质量的DNA,在对内标准基因Lectin进行扩增的基础上,设计相应的特异性引物,建立了稳定的定性PCR反应体系,对35S启动子基因、外源目的基因Cp4-epsps基因进行了扩增,发现豆粕、豆奶粉、豆腐、豆皮、豆豉中含有转基因成分,而其它产品中未发现转基因成分存在.     

丝氨酸对葡萄酒酿造过程中酿酒酵母产H2S的形成研究

为探究丝氨酸对葡萄酒酿造过程中酿酒酵母产H2S的影响,以自主筛选的本土酿酒酵母32y12为研究对象,分别在正常氮源（300 mg N/L）和低浓度氮源（150 mg N/L）条件下,比较了外源丝氨酸的添加对酿酒酵母32y12发酵过程中产H2S的影响。结果显示,相对于正常氮源水平,低氮条件下外源添加140.8 mg/L（5倍）和281.5 mg/L（10倍）丝氨酸时,H2S释放量显著增加,分别达到573.1 μL/L和798.6 μL/L。为了进一步研究酵母自身丝氨酸合成对H2S产生的影响,借助Cre-Loxp系统敲除了丝氨酸合成关键基因SER33,结果发现在不同氮源水平下,基因SER33的敲除均显著降低H2S产量（P＜0.05）,并且外源添加不同浓度丝氨酸也并不会显著增加基因SER33敲除菌株的H2S释放量（P＞0.05）。该结果为工业生产中针对低氮葡萄原料选择发酵助剂提供了理论支持。