重组牙鲆生长激素基因片断在毕赤酵母中的表达

为了开发一种有效的重组牙鲆生长激素(r-fGH)的方法,利用PCR的方法从牙鲆eDNA文库中克隆得到了牙鲆生长激素(fgh)的cDNA片断.接着将这个fgh片断克隆到整合型质粒pAO815,它可以在甲醇诱导启动子的调控下表达外源蛋白.利用这种包含一个fgh插入片段的克隆来构建含有2个和3个头尾顺序排列的fgh表达框的表达质粒.利用氯化锂转化的方法将所构建的质粒转化到毕赤酵母GS115,然后进行筛选、培养和0.5%甲醇诱导表达,最后得到重组表达的牙鲆生长激素.     

阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因克隆、表达及活性研究

目的:利用pET质粒原核表达体系克隆、表达阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,表达产物进行Ni-NTA柱纯化,利用α-葡萄糖苷酶分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性进行表达纯化合的蛋白活性鉴定,为进一步制备阪崎肠杆菌检测用单克隆抗体奠定了基础.方法:从阪崎肠杆菌ATCC29544标准菌株中克隆获得阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,连接pET22b( )表达载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达外源基因,分别检测不同诱导时间、不同浓度IPTG作用下表达产物,筛选高表达菌株.表达菌株大量培养后,超声波及蛋白酶K作用破菌,Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白,纯化产物进行酶活性的测定.结果:克隆获得的α-葡萄糖苷酶基因与NCBI收录的基因序列属等位基因,核苷酸位点有多处差异,氨基酸序列也有不同.构建表达载体并诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,目标蛋白相对分子质量约为65kD,与理论值相符.目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%.同时,由纯化结果可以看出,以500mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上.对表达产物进行过酶活性初步检测证重组的阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶能够分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖,产生蓝绿色.结论:本研究中克隆获得了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,通过构建pET22b( )-Glu表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的高表达菌株,表达产物具有较好的酶活性,纯化后纯度可达90%以上.     

干酪乳杆菌胞外多糖基因簇的调控基因在大肠杆菌中异源表达

为研究干酪乳杆菌胞外多糖的生物合成和转录调控,对其生物合成基因簇中假定的转录调控因子LC2W_2170进行克隆,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达。首先,利用PCR技术从干酪乳杆菌LC2W中扩增出目的基因LC2W_2170,将其插入到大肠杆菌表达载体p ET24a和p ET30a中,构建出LC2W_2170 N端或C端和N端均含有His蛋白标签的重组质粒。含上述质粒的E.coli经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析并未发现LC2W_2170蛋白可溶性表达。对LC2W_2170氨基酸序列利用Phobius服务器分析,发现该蛋白N端存在跨膜区(前27个氨基酸为跨膜序列)。切除此跨膜区域重新构建重组表达质粒后,在E.coli中成功实现LC2W_2170蛋白可溶性表达。研究为进一步纯化该转录调控因子,并研究其功能和对胞外多糖生物合成基因簇的转录调控机制奠定了基础。     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽在大肠杆菌中的表达纯化及功能鉴定

本研究构建了编码重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽基因的原核表达载体pET28a-rhCⅠ,并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。采用PCR的方法扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的cDNA序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a上;重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。利用SDS-PAGE和WesternBlot检测表达产物。大量表达重组蛋白,采用镍亲和层析进行纯化,并对纯化后的蛋白进行体外抗氧化研究以及促细胞增殖分析。结果表明,通过大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达获得了分子量约为40ku的重组蛋白,与预期相符。经镍亲和层析获得纯度较高的蛋白,通过DPPH实验证明其有一定的抗氧化活性;而且MTT实验证实该蛋白可以促进小鼠成纤维细胞3T3细胞的增殖,为其在食品、化妆品和医疗行业的应用提供一定的理论依据。     

海藻德合酶基因工程菌诱导表达条件的研究

实验将构建后的重组质粒pET21TreS转入大肠杆菌Rosetta gami(DE3)中,得到海藻糖合酶基因工程菌,并通过对培养时间、温度及诱导剂浓度等条件的优化,对其进行诱导表达,得到了该基因工程菌诱导表达的最适条件:发酵培养至菌体浓度(OD_(600))至0.6～0.8时,以1mmol/L浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTC),37℃,诱导2h后得到的蛋白表达量较高.     

分子伴侣共表达对重组蔗糖异构酶异源可溶性表达的影响

蔗糖异构酶(sucrose isomerase,SIase)在异麦芽酮糖的酶法制备中发挥着重要作用。为了提高重组蔗糖异构酶的可溶性表达,作者利用分子伴侣共表达策略将源自Klebsiella sp.LX3的基因SIase进行异源表达并研究了重组酶的酶学性质。利用酶切连接技术构建重组质粒pET-24b-SIase并转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行表达,发现其主要表达为包涵体。分别将携带4种分子伴侣蛋白基因的质粒(pKJE7、pGro7、pG-Tf2、pTf16)与含有目的基因的重组质粒在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中共表达,筛选到最佳分子伴侣质粒pGro7且提高了重组SIase的可溶性表达水平,其酶活力为14.8 U/mL,比未进行共表达的工程菌发酵酶活力(3.5 U/mL)有明显提高,进一步利用金属离子螯合层析技术纯化到SIase纯酶,酶学性质研究显示其最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.0。动力学常数K_m为(179.10±20.65) mmol/L、k_cat/K_m为(5.44±0.72)...     

人血清白蛋白-白介素-2融合蛋白在CHO细胞中的表达

白细胞介素-2在人体免疫应答中具有重要作用,常用于治疗肿瘤、肝炎和免疫缺陷性疾病等多种疾病,但因其体内半衰期短而限制了其临床应用。文中构建了含有融合蛋白基因HSA-IL-2的p MH3质粒,并通过电转染的方法转入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO细胞)中,利用p MH3质粒所携带的neo基因进行筛选,经96孔板培养并筛选得到稳定表达目的蛋白质的重组细胞,融合蛋白HSA-IL-2表达量达到2.26 mg/L。利用反转录PCR和Western blot对重组细胞鉴定后发现,融合蛋白编码基因整合入重组CHO细胞基因组中,而且融合蛋白同时具有HSA和IL-2双重免疫原性。利用对IL-2具有依赖性的CTLL-2细胞进行活性分析后发现,筛选得到的表达细胞分泌得到的融合蛋白具有较高的生物活性,表明成功构建具有表达IL-2生物活性能力的CHO细胞。     

酿酒酵母环核苷酸磷酸二酯酶1的异源表达、分离纯化与活性检测

制备获得高纯度酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)环核苷酸磷酸二酯酶1(phosphodiesterase 1,PDE1)蛋白,以pGM-T-S.cerevisiae基因组为模板,聚合酶链式反应扩增目的基因,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21中,并诱导表达。高压破碎菌体提取物先后通过亲和层析纯化系统(Ni-NAT柱)、离子交换纯化系统(Q-Sepharose柱)和分子筛纯化系统(Sephacryl S200柱)进行纯化,经酶活性测定显示,纯化后的蛋白活性达92%。研究结果可为将来该蛋白的晶体学分析和在酿酒酵母中的代谢调控提供前期基础。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

人抗氧化蛋白-1在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

为得到较纯的具有活性的人抗氧化蛋白Peroxiredoxin1(Prx1),本文先用PCR的方法扩增了人Prx1的cDNA序列,然后将其连接到pET28表达载体上,从而构建了编码全长的人抗氧化蛋白-1基因的pET28-Prx1原核表达质粒。经双酶切及测序鉴定后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,并通过SDS-PAGE和western blot来鉴定表达产物。随后用Ni-NTA螯合亲和层析的方法纯化重组蛋白,并测定该酶的米氏常数,用质粒保护实验鉴定该蛋白其活性。最终表达载体经酶切和测序鉴定证实构建成功,表达产物在SDS-PAGE和western blot图的25 kD左右,与prx1真实的蛋白分子量相符,说明Prx1蛋白成功表达。Prx1纯化后产量达到7.59 mg/g菌体,纯度达到88.50%。纯化后的Prx1在37℃和pH 7.4的条件下催化H2O2反应的米氏常数Km为2.06×10-4 mol/L,质粒保护实验表明Prx1可以保护pUC18质粒免受氧化损伤。因此,Prx1在大肠杆菌中成功表达并得到较纯的活性蛋白。