牛γ-干扰素基因在大肠杆菌中的克隆

根据牛γ干扰素(bovIFN γ)基因的cDNA序列设计了一对引物。应用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)技术,从奶牛脾脏淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段,将RT PCR产物克隆到pMD18 T载体中,经过限制性酶切分析、测序证实扩增得到的bovIFN γ基因序列正确。将该基因片段切下并克隆到大肠杆菌表达载体pGEX 4T 1中,将pGEX 4T 1/bovIFN γ转化到大肠杆菌中DH5α中。     

家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426.该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj.Bmbzj基因全长661bp,由99 bp的5'端非翻译区序列(5'UTR)、486 bp的开放读码框(ORF)和76 bp的3'端非翻译区序列(3'UTR)组成.生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽.将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中.     

人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因人α-防御素HNP-1，提取人外周静脉血液总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PCR的方法扩增得到长度约为380bp的防御素(Defensin)基因片段，并将该扩增产物连接入pMD18-T载体，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行核苷酸序列测定，获得α-防御素HNP-1基因克隆。用序列处理在线工具包分析HNP-1基因结构。     

人α-防御素HNP-1基因克隆及其结构分析

为了获得一种具有生物学活性的小分子多肽基因人α 防御素HNP 1,提取人外周静脉血液总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到长度约为380bp的防御素(De fensin)基因片段,并将该扩增产物连接入pMD18 T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,对PCR鉴定含有目的片段的克隆进行核苷酸序列测定,获得α 防御素HNP 1基因克隆。用序列处理在线工具包分析HNP 1基因结构。     

CTB-InsB融合基因在大肠杆菌中的表达研究

构建了一种霍乱毒素B亚基（CTB）与人胰岛素B链（InsB）的融合基因，并克隆入表达载体pGEX-4T-1中，命名为pGEX—CTB-InsB。该融合蛋白在大肠杆菌中的表达产物以包涵体形式存在，分子量约为43kDa。包涵体经溶解和复性后，使用GSTrapFF亲和层析柱纯化得到融合蛋白。经SDS-PAGE和Western免疫印迹分析证实纯化蛋白为重组目的蛋白。     

芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁-α一鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物，从Absidia sp．R9g的总RNA出发，通过逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)扩增出芦丁-α-鼠李糖苷酶基因片段。将RT-PCR获得的1条1．6kb的目的条带与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。     

DNA聚合酶基因pfu的克隆及初步表达

通过分子克隆技术从嗜热极端微生物Pyrococcus furiosus中克隆出高热稳定性的pfu DNA聚合酶基因，琼脂糖凝胶电泳显示基因片段的长度为2．3kb，将其转化入大肠杆菌中并获得初步表达。重组酶成功地扩增了800bp的DNA片段。     

植酸酶植物基因工程载体的构建

通过PCR方法从植酸酶基因克隆载体PUC18／phyAI中扩增出Aspergillus.ficuumAS3.324植酸酶（phyA）基因,经酶切连接后克隆到植物中间载体pBI121,获得含AS3.324植酸酶基因的质粒pBI121/phyAⅡ。用冻融法将pBI121/phyAⅡ导入表达载体根 农杆菌LBA4404中。经过抗生素筛选、PCR检测,证明得到了正确表达载体－－LBA4404／pBI121/phyAⅡ,此表达载体可用于植酸酶基因转化烟草的研究。     

杂合抗菌肽MT在大肠杆菌中的融合表达

为了在大肠杆菌中表达杂合抗菌肽Magainin-Thanatin(MT).通过大肠杆菌密码子偏爱性优化两抗菌肽基因序列,SOE-PCR技术构建克隆载体并测序;将其转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)中构建基因工程菌,表达产物做抑菌活性分析.结果在本研究中经SOE-PCR拼接后得到了杂合肽片段,成功构建了表达载体pGEX-6P-1-MT;转化后得到了重组菌株pGEX-6P-1-MT/BL21(DE3);获得诱导产物分子质量约3.35kDa;其对大肠杆菌DH5α、金黄色葡萄球菌等均有抑制作用.这表明杂合肽MT可以在大肠杆菌BL21(DE3)中融合分泌表达且具有抗菌活性.     

芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁 α 鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidiasp.R9g的总RNA出发,通过逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)扩增出芦丁 α 鼠李糖苷酶基因片段。将RT PCR获得的1条1.6kb的目的条带与pMD18 T载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。     

蜡样芽胞杆菌深圳株754-1 PLC基因的克隆及表达

以本实验室分离筛选的高产PLC的蜡样芽胞杆菌深圳株754—1为供体菌，以大肠杆菌DH5仅和BL21（DE3）为受体菌，构建高效表达胞内PLC的工程菌。以754-1菌基因组为模板。经PCR扩增，将得到的PLC基因连接到T载体上，转入大肠杆菌DH5仅。经Amp抗性筛选的阳性克隆子提取重组质粒，双酶切，回收含PLC基因的片段并将其克隆到pGEX-KG载体，获得重组质粒pGEX-KG-PLM，该重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。用IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析，在分子量为38kd处有一条明显的表达带。     

圆弧青霉脂肪酶基因的克隆和表达

圆弧青霉PG37总RNA甲醛变性电泳呈现真核生物所特有的28SrRNA和18SrRNA条带。根据PG37所产碱性脂肪酶（Lip PC）N末端氨基酸残基序列和真核生物mRNA在3'端具有poly(A）等所提供的生物信息，采用RT－PCR技术扩增了Lip PC成熟肽和3'非编码区的cDNA片段，并将该PCR产物直接克隆至pUCm-T载体中。序列分析表明，Lip PC含有258个氨基酸残基，其中保守的五肽序列为Gly-His-Ser-Leu-Gly。进一步采用ClonTech公司的Smart^TM PCR cDNA文库构建试剂盒，扩增、克隆和测定了自转录起始点至编码区的cDNA片段，从而完成了Lip PC完整cDNA的分析测定。最后将编码完整脂肪酶蛋白质的cDNA克隆至pGEX-5X-3表达载体中，SDSPAGE检测结果表明，大肠杆菌BL21所表达的GST－Lip PC融合蛋白质分子质量约为53ku。     

假单胞菌ZL13邻苯二酚2,3-双加氧酶基因的克隆表达

寻找新型高效石油降解菌,并研究其相关基因一直是石油降解领域的热点.本文以细菌Pseudomonas sp.ZL13的降解性质粒pZL-1的DNA为模板,通过PCR扩增的方法进行基因克隆,得到邻苯二酚2,3-双加氧酶基因.序列分析结果表明,该基因大小为924bp,编码307个氨基酸;序列同源性比较结果显示,该基因与荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的基因序列的相似性较高,处于同一分支.将目的基因连接到pGEX-4T-2表达载体上,在E.coli BL21中成功表达,转化子具有原油降解能力.     

贻贝粘合蛋白基因转化巴斯德毕赤酵母

贻贝粘合蛋白可以作成性能优异的生物防腐剂和粘合剂。报道了一种新的贻贝(Mytilus sp．JHX-2002)的粘合蛋白基因(msfp-1)转化载体的构建，以及该质粒转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris，Gs115)。将克隆载体pUC118／msfp-1以及质粒pPIC9K分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，连接获得表达载体pPIC9K／msfp-1，电击法转化至Gs115中。组氨酸野生型检测以及PCR检测，从而获得msfp-1基因重组酵母菌Gs115／msfp-1。     

抗菌肽基因在E．Coli JM109中的克隆表达

合成5条50～70bp的DNA片段，用“片段拼凑”的方法通过三步PCR扩增得到目的基因，天蚕素基因被克隆到PUC19载体上，再转化大肠杆菌JM109，电泳分析重组质粒，确定天蚕素基因已转化到JM10g上，摇床发酵转化子，IPTG诱导表达目的肽，最后提纯表达产物，SDS-PAGE电泳分析表明有特异性带出现，荧光色谱分析表明表达肽与目的肽组成一致，最后确定天蚕素在JM109中得到表达，抑菌圈活性实验表明，表达肽具有一定抗菌活性。     

芽孢杆菌BC4铬抗性相关基因chrA的克隆表达

以芽孢杆菌BC4菌株为对象,通过对其铬抗性相关基因chr A的克隆表达来测定其编码蛋白ChrA还原Cr(Ⅵ)的能力以及该蛋白在芽孢杆菌Cr(Ⅵ)去除中的作用,可帮助进一步阐明芽孢杆菌与Cr(Ⅵ)的作用机理,并为芽孢杆菌应用于铬污染治理奠定理论基础。PCR扩增出芽孢杆菌BC4菌株铬抗性相关基因chr A,PCR产物经克隆与测序,得到chr A完整的DNA序列。该序列大小为1182bp,共编码393个氨基酸,预测编码蛋白分子量为43kDa。根据利用NCBI所进行的BLAST序列比对结果,判断该基因为铬转运蛋白编码基因。将chr A基因PCR产物双酶切后连接到表达载体pET28b并转化进大肠杆菌BL21中,对其表达产物进行分析。结果表明,chr A基因在大肠杆菌BL21中表达约43kDa的蛋白,与预期结果相符;重组菌株对Cr(Ⅵ)的耐受能力高于对照菌株,说明ChrA蛋白在芽孢杆菌BC4的Cr(Ⅵ)抗性机制中起重要作用,且重组菌株对Cr(Ⅵ)具备较强的抗性。     

丝状真菌斜卧青霉JUA-10具有启动子功能的DNA片段的克隆与表达

将斜卧青霉JUA－10染色体DNA的BamHI或PstI片段连接到大肠杆菌的启动子探针型载体pSUPV4上，克隆了7个不同大小的具有启动子功能的DNA片段。卡那霉素抗性试验表明，含重组质粒的大肠杆菌均能耐受100μg/ml以上的卡那霉素，最高可达1100μg/ml。说明斜卧青霉的某些DNA片段能在大肠杆菌中有铲地启动基因表达。取抗性水平最高的pPdsuI进一步进行限制酶谱分析，表明插入片段的分子量为2.4Kb.Southern杂交分析结果表明该插入DNA片段与斜卧青霉染色体DNA具同源性。     

用CODEHOP设计简并引物克隆B49乙酸激酶基因片段

利用CODEHOP设计细菌乙酸激酶的简并引物,选用1对引物ACK-J1以高效产氢菌B49基因组DNA进行PCR,得到655bp PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,发现此DNA产物与其他乙酸激酶基因有高度的相似性.所克隆的序列为B49的乙酸激酶基因片段.用CODEHOP程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高.该基因的成功克隆将为高效产氢菌B49代谢工程研究和降低其反应器酸化研究提供科学依据.     

建兰花色调控关键基因的克隆与表达

对建兰花色形成的关键调控基因(CHS)编码区片段克隆至pET28a质粒,转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3).SDS-PAGE检测表达产物,针对IPTG浓度、温度与时间等因素,优化其最佳诱导表达条件.结果显示:(1)总RN A提取质量高,经反转录成cDNA,设计引物通过PCR扩增,琼脂糖电泳显示片段为1200 bp;(2)对转化子进行菌落PCR与质粒双酶切鉴定,片段大小均为1200 bp与预计相符,经测序获得片段插入方向正确,未发生突变,可用于蛋白诱导表达;(3)诱导表达优化显示,温度为37℃、IPTG浓度1 mM及诱导时间6 h是重组子(pET28-CeCHS1)在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中诱导表达的最佳条件.     

异源包装家蚕核型多角体病毒的特性研究

利用PCR方法分离AcMNPV多角体蛋白基因及其启动子的特异片段 ,将该基因片段正确克隆到转移载体pBacPAK(API 4)中 ,得到重组转移载体pBacOAc(API4)。将它与已缺失多角体蛋白基因的BmNPV(即 :CrBK)基因组DNA共转染BmN细胞 ,将AcMNPV多角体蛋白基因及慈菇蛋白酶抑制剂基因定向克隆到CrBK基因组中 ,得重组病毒BmNPV(OAc -API4)。发现该重组病毒能被AcMNPV多角体蛋白所识别 ,并形成多角体包埋型病毒 ;CrBK粒子能被正确包装 ,同时也能表达慈菇蛋白酶抑制剂。比较了该重组病毒在家蚕细胞及家蚕幼虫中的增殖情况 ,发现它的芽生型病毒能正常感染家蚕细胞和经皮下注射的家蚕幼虫 ,然而其包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫。表明NPV的经口感染与多角体蛋白的种类有关。